Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l’alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.
La spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è un metodo potente per la caratterizzazione biofisica dei cambiamenti conformazionali enzimatici e delle interazioni enzima-substrato. Tra i suoi numerosi benefici, HDX-MS consuma solo piccole quantità di materiale, può essere eseguito in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura enzima/substrato, e può fornire informazioni risolte spazialmente sulla dinamica enzimatica conformazionale, anche per grandi enzimi e complessi multiproteina. Il metodo è iniziato dalla diluizione dell’enzima di interesse in tampone preparato in D2O. Ciò innesca lo scambio di prozio in ammidi di legame peptidico (N-H) con deuterio (N-D). Nei punti di tempo di scambio desiderati, le aliquote di reazione vengono spente, l’enzima viene proteoliizzato in peptidi, i peptidi sono separati dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC), e il cambiamento di massa di ogni peptide (a causa dello scambio di idrogeno con deuterio) è registrato da MS. La quantità di assorbimento del deuterio da parte di ogni peptide dipende fortemente dall’ambiente locale di legame idrogeno di quel peptide. I peptidi presenti in regioni molto dinamiche del deuterio di scambio enzimatico molto rapidamente, mentre i peptidi derivati da regioni ben ordinate subiscono uno scambio molto più lento. In questo modo, il tasso HDX riporta la dinamica conformazionale enzimatica locale. Le perturbazioni ai livelli di assorbimento del deuterio in presenza di diversi ligandi possono quindi essere utilizzate per mappare i siti di legame dei ligandi, identificare le reti allosteriche e comprendere il ruolo della dinamica conformazionale nella funzione enzimatica. Qui, illustriamo come abbiamo usato HDX-MS per comprendere meglio la biosintesi di un tipo di prodotti naturali peptidici chiamati lanthipeptides. I lanthipeptidi sono peptidi geneticamente codificati che vengono modificati post-traslazionemente da grandi enzimi multifunzionali, conformazionali dinamici che sono difficili da studiare con i tradizionali approcci di biologia strutturale. HDX-MS fornisce una piattaforma ideale e adattabile per studiare le proprietà meccaniche di questi tipi di enzimi.
Le proteine sono molecole strutturalmente dinamiche che campionano diverse conformazioni su scale di tempo che vanno dalla vibrazione del legame su scala femtoseconda ai riarrangiamenti di interi domini proteici che possono verificarsiper molti secondi 1. Queste fluttuazioni conformazionali sono spesso aspetti critici della funzione enzimatica/proteica. Ad esempio, i cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando sono spesso di fondamentale importanza per modulare la funzione enzimatica, sia organizzando i residui attivi del sito necessari per la catalisi, definendo siti di legame del substrato in meccanismi cinetici sequenziali, proteggendo gli intermedi reattivi dall’ambiente, sia modulando la funzione enzimatica attraverso reti allosteriche. Recenti studi hanno anche dimostrato che la dinamica conformazionale può essere conservata durante l’evoluzione e che le perturbazioni ai moti molecolari conservati possono essere correlate con i cambiamenti nella specificità del substrato e l’emergere di nuove funzionienzimatici 2,3.
Negli ultimi anni, la spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è rapidamente emersa come una potente tecnica per sondare come i paesaggi conformazionali proteici rispondono a perturbazioni come il legame del ligando o la mutagenesi4,5,6,7. In un tipico esperimento HDX-MS (Figura 1), una proteina di interesse viene messa in tampone preparata in D2O, che innesca la sostituzione di protoni scambiabili con solventi con deuteria. Il tasso di scambio della moietà ammide dei legami peptidici dipende fortemente dal pH, dalla sequenza amminoacidica locale e dall’ambiente strutturale locale dell’ammide8. Le ammidi impegnate nelle interazioni di legame idrogeno (come quelle presenti in α-eliche e β fogli) si scambiano più lentamente delle ammidi nelle regioni non strutturate della proteina che sono esposte al solvente sfuso. Pertanto, l’estensione dell’assorbimento del deuterio è un riflesso della struttura dell’enzima. Ci si aspetta che enzimi conformi alla dinamica, o che subiscono transizioni strutturali al legame del ligando, producano una risposta HDX misurabile.
La base meccanicistica per il lento tasso di cambio di un’ammide strutturata è illustrata nella figura 25,8,9. Per sottoporsi all’HDX, la regione strutturata deve prima campionare transitoriamente una conformazione dispiegata, in modo che le molecole di solvente che catalizzano lo scambio di HDX attraverso uno specifico meccanismo acido/base chimica abbiano accesso all’ammide scambiabile. In definitiva, le grandezze relative del tasso di cambio chimico (kchem) e i tassi di piegatura e ripiegamento (kaperto e kvicino) determinano il tasso di HDX misuratonell’esperimento 5,8. Da questo semplice modello cinetico, è chiaro che l’estensione dell’assorbimento del deuterio rifletterà la dinamica conformazionale sottostante (come definita da kopen e kclose). La maggior parte degli esperimenti HDX-MS viene eseguita in un flusso di lavoro dal basso verso l’alto in cui, a seguito della reazione di scambio, la proteina di interesse viene digerita in peptidi e l’assorbimento del deuterio da parte di ciascun peptide viene misurato come un aumento dellamassa 7. In questo modo, HDX-MS consente di mappare le perturbazioni alla dinamica enzimatica conformazionale sulla scala spaziale locale dei peptidi, consentendo al ricercatore di valutare come la perturbazione alteri la dinamica in diverse regioni dell’enzima di interesse.
I vantaggi dell’approccio HDX-MS per chiarire la dinamica strutturale delle proteine sono numerosi. In primo luogo, il metodo può essere eseguito con piccole quantità di proteine native o su complessi proteici in sistemi con struttura quaternaria10. Non è nemmeno necessario che il preparato enzimatico utilizzato nel saggio sia altamente purificato11,12, purché il flusso di lavoro HDX-MS dal basso verso l’alto fornisca un numero sufficiente di peptidi identificati con sicurezza che coprono la sequenza proteica di interesse. Inoltre, HDX-MS può fornire informazioni sulla dinamica conformazionale in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura proteica site-specific come sarebbe utilizzata negli studi di fluorescenza a singolamolecola 13e non esiste un limite di dimensione al complesso proteico o proteico che può essere studiato (il che rende impegnativi approcci come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare [NMR])7,14. Infine, i metodi HDX-MS risolti nel tempo possono essere utilizzati per studiare proteine intrinsecamente disordinate, che sono difficili da studiare con la cristallografia a raggi X15,16,17,18. La limitazione principale di HDX-MS è che i dati sono a bassa risoluzione strutturale. I dati HDX-MS sono utili per indicare dove la dinamica conformazionale sta cambiando e per rivelare cambiamenti conformazionali accoppiati, ma spesso non forniscono molte informazioni sul preciso meccanismo molecolare che guida il cambiamento osservato. Recenti progressi nella combinazione di metodi di dissociazione da cattura elettronica con dati proteina HDX-MS hanno mostrato promesse per la mappatura dei siti di scambio a singoli residui di amminoacidi19, ma gli studi biochimici e strutturali di follow-up sono ancora spesso necessari per fornire chiarezza ai modelli strutturali inoltrato dai dati HDX-MS.
Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato per lo sviluppo di un test HDX-MS20. I protocolli di preparazione del campione presentati di seguito dovrebbero essere generalmente applicabili a qualsiasi proteina che mostri una buona solubilità in tamponi acquosi. Metodi di preparazione dei campioni più specializzati e flussi di lavoro HDX-MS sono disponibili per le proteine di quanto sia necessario saggiare in presenza di detergente o fosfolipidi21,22,23,24. Le impostazioni strumentali per la raccolta dei dati HDX-MS sono descritte per uno spettrometro di massa quadrupolo ad alta risoluzione accoppiato al sistema di cromatografia liquida. Dati di complessità e risoluzione simili potrebbero essere raccolti su uno qualsiasi dei numerosi sistemi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) disponibili in commercio. Vengono inoltre forniti aspetti chiave del trattamento dei dati utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio. Presentiamo anche linee guida per la raccolta e l’analisi dei dati coerenti con le raccomandazioni formulate dalla più ampia comunità HDX-MS12. Il protocollo descritto viene utilizzato per studiare le proprietà strutturali dinamiche di HalM2, una sintetasi lanthipeptide che catalizza la maturazione multistep di un prodotto naturale peptide antimicrobico20. Illustriamo come HDX-MS può essere utilizzato per rivelare siti di legame del substrato e proprietà allosteriche che sono sfuggite alla caratterizzazione precedente. Diversi altri protocolli sulle proteine HDX-MS sono stati pubblicati negli ultimi anni25,26. Insieme al presente lavoro, questi contributi precedenti dovrebbero fornire al lettore una certa flessibilità nella progettazione sperimentale.
Il flusso di lavoro HDX-MS presentato in questo protocollo fornisce una piattaforma straordinariamente robusta per mappare la distribuzione spaziale di elementi strutturalmente dinamici nelle proteine e per indagare come queste dinamiche cambiano in risposta alla perturbazione (legame del ligando, mutagenesi enzimatica, ecc.). L’HDX-MS presenta diversi vantaggi distinti rispetto ad altri approcci di biologia strutturale che sono comunemente usati per studiare la dinamica conformazionale. In particolare, sono necessarie s…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dal Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, dalla Canadian Foundation for Innovation e dai fondi di start-up della McGill University.
Reagents | |||
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
ATP | SIGMA | a2383-5G | |
D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
formic acid | Thermo Fisher | 28905 | |
guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Magnesium chloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
Potassium chloride | BioBasic | PB0440 | |
potassium phosphate | BioBasic | PB0445 | |
TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide was synthesized upon request |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
software | |||
Deuteros | Andy M C Lau, et al | version 1.08 | |
DynamX | Waters | version 3.0 | |
MassLynx | Waters | version 4.1 | |
Protein Lynx Global Server (PLGS) |
Waters | version 3.0.3 | |
PyMOL | Schrödinger | version 2.2.2 | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Instrument and equipment | |||
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column | Waters | 186002346 | |
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column | Waters | 186003978 | |
ACQUITY UPLC M-Class HDX System | Waters | ||
HDX Manager | Waters | ||
microtip pH electrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn | Waters | 186007233 | |
Waters Synapt G2-Si | Waters |