Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden¹. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, het afschermen van reactieve tussenproducten van de omgeving, of door het moduleren van de enzymfunctie via allosterische netwerken. Recente studies hebben ook aangetoond dat conformationele dynamica gedurende de gehele evolutie kan worden behouden en dat verstoringen van geconserveerde moleculaire bewegingen kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in substraatspecifiekheid en de opkomst van nieuwe enzymfuncties^2,3.

In de afgelopen jaren is waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) snel naar voren gekomen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe eiwitconforme landschappen reageren op verstoringen zoals ligandbinding of mutagenese^4,5,6,7. In een typisch HDX-MS-experiment(figuur 1)wordt een interessant eiwit in een buffer geplaatst die is bereid in D₂O, waardoor protonen die oplosmiddelen kunnen worden uitgewisseld, worden vervangen door deuteria. De wisselkoers van de amidemoiety van de peptidebindingen hangt sterk af van de pH, de lokale aminozuursequentie en van de lokale structurele omgeving van de amide⁸. Amiden die zich bezighouden met waterstofbindingsinteracties (zoals die aanwezig zijn in α-helices en β-sheets) wisselen langzamer uit dan amides in ongestructureerde gebieden van het eiwit die worden blootgesteld aan bulkoplosmiddel. De omvang van de deuteriumopname is dus een weerspiegeling van de structuur van het enzym. Enzymen die conformationeel dynamisch zijn, of die structurele overgangen ondergaan bij ligandbinding, zouden naar verwachting een meetbare HDX-respons opleveren.

De mechanistische basis voor de trage wisselkoers van een gestructureerdeamide is weergegeven in figuur 2^5,8,9. Om HDX te ondergaan, moet het gestructureerde gebied eerst een uitgevouwen conformatie tijdelijk bemonsteren, zodat de oplosmiddelmoleculen die hdx-uitwisseling katalyseren via een specifiek zuur/base chemisch mechanisme, toegang hebben tot het verwisselbareamide. Uiteindelijk bepalen de relatieve omvang van de chemische wisselkoers (k_chem) en de vouw – en vouwkoersen (k_open en k_sluiten) de HDX-koers gemeten in het experiment^5,8. Vanuit dit eenvoudige kinetische model is het duidelijk dat de mate van deuteriumopname de onderliggende conformationele dynamiek weerspiegelt (zoals gedefinieerd door k_open en k_close). De meeste HDX-MS-experimenten worden uitgevoerd in een bottom-up workflow waarbij, na de uitwisselingsreactie, het eiwit van belang wordt verteerd in peptiden en de deuteriumopname door elk peptide wordt gemeten als een toename van massa⁷. Op deze manier maakt HDX-MS het mogelijk om verstoringen van enzymconformatiedynamiek in kaart te brengen op de lokale ruimtelijke schaal van peptiden, waardoor de onderzoeker kan beoordelen hoe de verstoring de dynamiek in verschillende regio’s van het enzym van belang verandert.

De voordelen van de HDX-MS-aanpak voor het ophelderen van de structurele dynamiek van eiwitten zijn talrijk. Ten eerste kan de methode worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden inheems eiwit of op eiwitcomplexen in systemen met quaternaire structuur¹⁰. Het is zelfs niet nodig dat het enzympreparaat dat in de test wordt gebruikt, sterk wordt gezuiverd^11,12, zolang de bottom-up HDX-MS-workflow een voldoende aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden biedt die de eiwitsequentie van belang dekken. Bovendien kan HDX-MS informatie verstrekken over conformatiedynamiek onder bijna inheemse omstandigheden zonder dat locatiespecifieke eiwitetikettering nodig is, zoals zou worden gebruikt in fluorescentiestudies met één molecuul¹³, en er is geen groottelimiet voor het eiwit – of eiwitcomplex dat kan worden onderzocht (waardoor benaderingen zoals nucleaire magnetische resonantie [NMR] spectroscopie uitdagend zijn)^7,14. Ten slotte kunnen tijd-opgeloste HDX-MS-methoden worden gebruikt om intrinsiek verstoorde eiwitten te bestuderen, die moeilijk te bestuderen zijn met röntgenkristallografie^15,16,17,18. De belangrijkste beperking van HDX-MS is dat de gegevens een lage structurele resolutie hebben. HDX-MS-gegevens zijn nuttig om aan te geven waar de conformatiedynamiek verandert en om gekoppelde conformationele veranderingen te onthullen, maar ze geven vaak niet veel inzicht in het precieze moleculaire mechanisme dat de waargenomen verandering aanstuurt. Recente vooruitgang in de combinatie van elektronenafvangdissociatiemethoden met eiwit HDX-MS-gegevens heeft veelbelovend aangetoond voor het in kaart brengen van uitwisselingslocaties naar enkelvoudige aminozuurresiduen¹⁹, maar follow-up biochemische en structurele studies zijn nog steeds vaak nodig om duidelijkheid te verschaffen aan structurele modellen die worden doorgestuurd door HDX-MS-gegevens.

Hieronder wordt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van een HDX-MS-test gepresenteerd²⁰. De onderstaande monstervoorbereidingsprotocollen moeten algemeen toepasbaar zijn op elk eiwit dat een goede oplosbaarheid vertoont in waterige buffers. Er zijn meer gespecialiseerde monsterbereidingsmethoden en HDX-MS-workflows beschikbaar voor eiwitten dan in aanwezigheid van detergentia of fosfolipiden^21,22,23,24. Instrumentele instellingen voor HDX-MS-gegevensverzameling worden beschreven voor een quadrupole-tijd-of-flight massaspectrometer met hoge resolutie gekoppeld aan een vloeistofchromatografiesysteem. Gegevens over vergelijkbare complexiteit en resolutie kunnen worden verzameld op een van een aantal in de handel verkrijgbare lc-ms-systemen (liquid chromatography-mass spectrometry). Belangrijke aspecten van de gegevensverwerking met behulp van een commercieel beschikbaar softwarepakket worden ook verstrekt. We presenteren ook richtlijnen voor het verzamelen en analyseren van gegevens die in overeenstemming zijn met aanbevelingen van de bredere HDX-MS-gemeenschap¹². Het beschreven protocol wordt gebruikt om de dynamische structurele eigenschappen van HalM2 te bestuderen, een lanthipeptide synthetase dat de multistep rijping van een antimicrobieel peptide natuurlijk product katalyseert²⁰. We illustreren hoe HDX-MS kan worden gebruikt om substraatbindingssites en allosterische eigenschappen te onthullen die eerdere karakterisering hebben ontweken. Verschillende andere protocollen inzake eiwit HDX-MS zijn de afgelopen jaren gepubliceerd^25,26. Samen met het huidige werk moeten deze eerdere bijdragen de lezer enige flexibiliteit bieden in experimenteel ontwerp.