Summary

Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Published: May 04, 2020
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Summary

As sintetizações lanthipeptide catalisam reações multistep durante a biossíntese de produtos naturais de peptídeos. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho contínuo, de baixo para cima, de espectrometria de massa de troca de hidrogênio -deutério (HDX-MS) que pode ser empregado para estudar a dinâmica conformacional das sintetizações de lanthipeptídeo, bem como outras enzimas semelhantes envolvidas na biossíntese de produtos naturais peptídeos.

Abstract

Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) é um método poderoso para a caracterização biofísica de alterações conformacionais enzimáticos e interações entre enzimas enzimistas. Entre seus muitos benefícios, o HDX-MS consome apenas pequenas quantidades de material, pode ser realizado em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem enzimada/substrato, e pode fornecer informações espacialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional enzimático– mesmo para grandes enzimas e complexos multiproteínas. O método é iniciado pela diluição da enzima de interesse em tampão preparado em D2O. Isso desencadeia a troca de protium em peptídeos (N-H) com deutério (N-D). Nos pontos de tempo de troca desejados, as alíquotas de reação são saciadas, a enzima é proteolisada em peptídeos, os peptídeos são separados por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC), e a mudança na massa de cada peptídeo (devido à troca de hidrogênio por deutério) é registrada pela MS. A quantidade de absorção de deutério por cada peptídeo depende fortemente do ambiente local de ligação de hidrogênio desse peptídeo. Peptídeos presentes em regiões muito dinâmicas do deutério de troca de enzimas muito rapidamente, enquanto peptídeos derivados de regiões bem ordenadas passam por troca muito mais lentamente. Desta forma, a taxa HDX relata a dinâmica conformacional da enzima local. Perturbações aos níveis de absorção de deutério na presença de diferentes ligantes podem então ser usadas para mapear sites de ligação de ligantes, identificar redes alusicais e entender o papel da dinâmica conformacional na função enzimática. Aqui, ilustramos como usamos o HDX-MS para entender melhor a biossíntese de um tipo de peptídeos naturais chamados lanthipeptides. Lanthipeptídeos são peptídeos geneticamente codificados que são modificados pós-translacionalmente por enzimas grandes, multifuncionais e conformacionalmente dinâmicas que são difíceis de estudar com abordagens tradicionais de biologia estrutural. O HDX-MS fornece uma plataforma ideal e adaptável para investigar as propriedades mecanicistas desses tipos de enzimas.

Introduction

Proteínas são moléculas estruturalmente dinâmicas que amostram diferentes conformações em escalas de tempo que vão desde vibração de ligação em escala femtosegundo até rearranjos de domínios proteicos inteiros que podem ocorrer ao longo de muitos segundos1. Estas flutuações conformais são frequentemente aspectos críticos da função enzima/proteína. Por exemplo, alterações conformais induzidas pela ligação de ligasão são muitas vezes criticamente importantes para a modulação da função enzimática, seja organizando resíduos ativos do local necessários para a catálise, definindo locais de ligação de substrato em mecanismos cinéticos sequenciais, protegendo intermediários reativos do ambiente ou modulando a função enzimática através de redes alostêmicas. Estudos recentes também mostraram que a dinâmica conformacional pode ser conservada ao longo da evolução e que perturbações a movimentos moleculares conservados podem ser correlacionadas com mudanças na especificidade do substrato e no surgimento de novas funções enzimárias2,3.

Nos últimos anos, a espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) tem emergido rapidamente como uma técnica poderosa para sondar como as paisagens conformais da proteína respondem a perturbações como ligadura ou mutagênese4,5,6,7. Em um experimento típico hdx-ms(Figura 1), uma proteína de interesse é colocada em tampão preparado em D2O, que desencadeia a substituição de prótons trocaveis de solventes por deuteria. A taxa de troca da moiety amida dos títulos de peptídeo depende fortemente do pH, da sequência local de aminoácidos, e do ambiente estrutural local da amida8. Amidas que estão engajadas em interações de ligação de hidrogênio (como as presentes em α-helices e β-folhas) trocam mais lentamente do que em meios em regiões não estruturadas da proteína que são expostas a solventes a granel. Assim, a extensão da captação do deutério é um reflexo da estrutura da enzima. Enzimas que são conformamente dinâmicas, ou que passam por transições estruturais sobre ligação ligante, seriam esperadas para produzir uma resposta HDX mensurável.

A base mecanicista para a taxa de câmbio lenta de uma amida estruturada é mostrada na Figura 25,8,9. Para se submeter ao HDX, a região estruturada deve primeiro amostrar transitoriamente uma conformação desdobrada, de tal forma que as moléculas de solvente que catalisam a troca de HDX através de um mecanismo químico ácido/base específico, tenham acesso ao amide tromável. Em última análise, as magnitudes relativas da taxa de câmbio química (kchem) e as taxas de dobra e reagem(kopen e kclose) determinam a taxa HDX medida no experimento5,8. A partir deste modelo cinético simples, é claro que a extensão da absorção do deutério refletirá a dinâmica conformacional subjacente (definida por kopen e kclose). A maioria dos experimentos HDX-MS são realizados em um fluxo de trabalho de baixo para cima onde, após a reação de troca, a proteína de interesse é digerida em peptídeos e a absorção do deutério por cada peptídeo é medida como um aumento na massa7. Dessa forma, o HDX-MS permite que perturbações para a dinâmica conformacional enzimária sejam mapeadas na escala espacial local dos peptídeos, permitindo que o pesquisador avalie como a perturbação altera a dinâmica em diferentes regiões da enzima de interesse.

As vantagens da abordagem HDX-MS para a dinâmica estrutural proteica elucidação são inúmeras. Em primeiro lugar, o método pode ser realizado com pequenas quantidades de proteína nativa ou em complexos proteicos em sistemas com estrutura quaternária10. Não é mesmo necessário que a preparação da enzima usada no ensaio seja altamente purificada11,12, desde que o fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima forneça um número suficiente de peptídeos confiantemente identificados que cobrem a sequência proteica de interesse. Além disso, o HDX-MS pode fornecer informações sobre a dinâmica conformacional em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem de proteínas específicas do local, como seria usado em estudos de fluorescência de moléculas únicas13, e não há limite de tamanho para o complexo proteico ou proteico que possa ser investigado (o que torna desafiadoras abordagens como ressonância magnética nuclear [NMR] espectroscopia)7,14. Finalmente, métodos HDX-MS resolvidos pelo tempo podem ser empregados para estudar proteínas intrinsecamente desordenadas, que são difíceis de estudar com cristalografia de raios-X15,16,17,18. A principal limitação do HDX-MS é que os dados são de baixa resolução estrutural. Os dados HDX-MS são úteis para apontar para onde a dinâmica conformacional está mudando e para revelar alterações conformais acopláveis, mas muitas vezes não fornecem muita visão do mecanismo molecular preciso que conduz a mudança observada. Avanços recentes na combinação de métodos de dissociação de captura de elétrons com dados de proteína HDX-MS mostraram-se promissores para mapear locais de troca para resíduos de aminoácidosúnicos 19,mas estudos bioquímicos e estruturais de acompanhamento ainda são frequentemente necessários para fornecer clareza aos modelos estruturais encaminhados pelos dados hdx-MS.

Abaixo, um protocolo detalhado para o desenvolvimento de um ensaio HDX-MS é apresentado20. Os protocolos de preparação da amostra apresentados abaixo devem ser geralmente aplicáveis a qualquer proteína que exaque boa solubilidade em tampões aquosos. Métodos de preparação de amostras mais especializados e fluxos de trabalho HDX-MS estão disponíveis para proteínas do que precisam ser avaliados na presença de detergentes ou fosfolipídios21,22,23,24. As configurações instrumentais para a coleta de dados HDX-MS são descritas para um espectrômetro de massa quadrúpole de alta resolução acoplado ao sistema de cromatografia líquida. Dados de complexidade e resolução semelhantes poderiam ser coletados em qualquer um dos vários sistemas de espectrometria de massa líquida (LC-MS) disponíveis comercialmente. Aspectos-chave do processamento de dados usando um pacote de software comercialmente disponível também são fornecidos. Também apresentamos diretrizes para coleta e análise de dados que são consistentes com as recomendações feitas pela comunidade HDX-MS mais ampla12. O protocolo descrito é usado para estudar as propriedades estruturais dinâmicas do HalM2, uma sintetização lanthipeptide que catalisa a maturação multistep de um produto natural de peptídeo antimicrobiano20. Ilustramos como o HDX-MS pode ser usado para revelar sites de ligação de substratos e propriedades alotésicas que iludiram a caracterização anterior. Vários outros protocolos sobre proteína HDX-MS foram publicados nos últimos anos25,26. Juntamente com o presente trabalho, essas contribuições anteriores devem proporcionar ao leitor alguma flexibilidade no design experimental.

Protocol

1. Preparação de reagentes deuterados e soluções de estoque de enzimas Prepare os reagentes necessários para as reações HDX (incluindo quaisquer buffers, sais, substratos, ligantes, etc.) como soluções de estoque concentradas de 100-200x em D2O (99,9% fração de átomo D). Prepare pelo menos 50 mL de solução de estoque tampão.NOTA: Para caracterização do HalM2, foram preparadas as seguintes soluções: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2 carboxyethyl)fospfina (TCEP), ATP de 750…

Representative Results

É necessário avaliar a qualidade da digestão proteolítica e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho para cada conjunto de injeções amostrais. Assim, antes de realizar ensaios HDX-MS, é essencial estabelecer condições efetivas para a proteólise da proteína de interesse, para a separação de peptídeos utilizando cromatografia líquida de fase inversa e mobilidade de íons de fase de gás, e para a detecção de peptídeos utilizando EM. Para isso, as amostras de referência para a proteína de interesse (cole…

Discussion

O fluxo de trabalho HDX-MS apresentado neste protocolo fornece uma plataforma notavelmente robusta para mapear a distribuição espacial de elementos estruturalmente dinâmicos em proteínas e para investigar como essas dinâmicas mudam em resposta à perturbação (ligação de ligante, mutagênese enzimática, etc.). O HDX-MS possui várias vantagens distintas sobre outras abordagens de biologia estrutural que são comumente usadas para investigar a dinâmica conformacional. Mais notavelmente, apenas pequenas quantidad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá, pela Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, pela Canadian Foundation for Innovation e pela McGill University.

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)
Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

References

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Cite This Article
Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

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