Summary

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Published: May 04, 2020
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Summary

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Abstract

La spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est une méthode puissante pour la caractérisation biophysique des changements conformationnels enzymatiques et des interactions enzyme-substrat. Parmi ses nombreux avantages, HDX-MS ne consomme que de petites quantités de matière, peut être effectuée dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage enzymatique/substrat, et peut fournir des informations spatialement résolues sur la dynamique conformationnelle des enzymes, même pour les grandes enzymes et les complexes multiprotéines. La méthode est initiée par la dilution de l’enzyme d’intérêt dans tampon préparé en D2O. Cela déclenche l’échange de protium dans les amides de liaison peptidique (N-H) avec le deutérium (N-D). Aux points de temps d’échange désirés, les aliquots de réaction sont trempés, l’enzyme est protéolysée en peptides, les peptides sont séparés par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), et le changement de masse de chaque peptide (dû à l’échange d’hydrogène contre du deutérium) est enregistré par la SEp. La quantité d’absorption de deutérium par chaque peptide dépend fortement de l’environnement local de liaison hydrogène de ce peptide. Les peptides présents dans les régions très dynamiques de l’échange d’enzymes deutérium très rapidement, tandis que les peptides dérivés de régions bien ordonnées subissent des échanges beaucoup plus lentement. De cette façon, le taux HDX rend compte de la dynamique conformationnelle des enzymes locales. Les perturbations des niveaux d’absorption du deutérium en présence de différents ligands peuvent ensuite être utilisées pour cartographier les sites de liaison ligand, identifier les réseaux allotériques et comprendre le rôle de la dynamique conformationnelle dans la fonction enzymatique. Ici, nous montrons comment nous avons utilisé HDX-MS pour mieux comprendre la biosynthèse d’un type de peptide produits naturels appelés lanthipeptides. Les lanthipeptides sont des peptides génétiquement codés qui sont modifiés post-translationnellement par de grandes enzymes multifonctionnelles et conformationnelles dynamiques qui sont difficiles à étudier avec les approches traditionnelles de biologie structurale. HDX-MS fournit une plate-forme idéale et adaptable pour étudier les propriétés mécanistes de ces types d’enzymes.

Introduction

Les protéines sont des molécules structurellement dynamiques qui échantillonnent différentes conformations sur des échelles de temps allant des vibrations des liaisons femtosecondes aux réarrangements de domaines protéiques entiers qui peuvent se produire sur plusieurs secondes1. Ces fluctuations conformationnelles sont souvent des aspects critiques de la fonction enzymatique/protéique. Par exemple, les changements conformationnels induits par la liaison ligand sont souvent d’une importance cruciale pour moduler la fonction enzymatique, soit en organisant les résidus actifs du site nécessaires à la catalyse, en définissant les sites de liaison du substrat dans les mécanismes cinétiques séquentiels, en protégeant les intermédiaires réactifs de l’environnement, soit en modulant la fonction enzymatique par l’intermédiaire de réseaux allotériques. Des études récentes ont également montré que la dynamique conformationnelle peut être conservée tout au long de l’évolution et que les perturbations des mouvements moléculaires conservés peuvent être corrélées avec des changements dans la spécificité du substrat et l’émergence de nouvelles fonctions enzymatiques2,3.

Ces dernières années, la spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est rapidement apparue comme une technique puissante pour sonder la façon dont les paysages conformationnels protéiques réagissent aux perturbations telles que la liaison ligand ou la mutagenèse4,5,6,7. Dans une expérience typique de HDX-MS (figure 1), une protéine d’intérêt est placée dans le tampon préparé dans D2O, ce qui déclenche le remplacement des protons échangeables de solvants par deutérium. Le taux de change de l’amide moiety des liaisons peptidiques dépend fortement du pH, de la séquence locale d’acides aminés, et de l’environnement structurel local de l’amide8. Les amidons engagés dans des interactions de liaison hydrogène (comme celles présentes dans les α-hélices et les feuilles de β) s’échangent plus lentement que les amides dans les régions non structurées de la protéine qui sont exposées au solvant en vrac. Ainsi, l’étendue de l’absorption de deutérium est un reflet de la structure de l’enzyme. On s’attendrait à ce que les enzymes qui sont conformationally dynamiques, ou qui subissent des transitions structurelles sur la liaison ligand, produisent une réponse mesurable de HDX.

La base mécaniste du taux de change lent d’un amide structuré est indiquée dans la figure 25,8,9. Pour subir le HDX, la région structurée doit d’abord échantillonner transitoirement une conformation dépliée, de sorte que les molécules solvantes qui catalysent l’échange HDX via un mécanisme chimique acide/de base spécifique, aient accès à l’amide échangeable. En fin de compte, les magnitudes relatives du taux de change chimique (kchem) et les taux de pliage et de refolding (kouvert et kfermer) déterminer le taux HDX mesuré dans l’expérience5,8. De ce modèle cinétique simple, il est clair que l’étendue de l’absorption de deutérium reflétera la dynamique conformationnelle sous-jacente (telle que définie par kouvert et kfermer). La plupart des expériences HDX-MS sont réalisées dans un flux de travail ascendant où, suite à la réaction d’échange, la protéine d’intérêt est digérée en peptides et l’absorption de deutérium par chaque peptide est mesurée comme une augmentation de la masse7. De cette façon, HDX-MS permet de cartographier les perturbations de la dynamique conformationnelle des enzymes à l’échelle spatiale locale des peptides, ce qui permet au chercheur d’évaluer comment la perturbation modifie la dynamique dans différentes régions de l’enzyme d’intérêt.

Les avantages de l’approche HDX-MS pour élucider la dynamique structurelle des protéines sont nombreux. Tout d’abord, la méthode peut être effectuée avec de petites quantités de protéines indigènes ou sur des complexes protéiques dans des systèmes à structure quaternaire10. Il n’est même pas nécessaire que la préparation enzymatique utilisée dans l’analyse soit fortement purifiée11,12, tant que le flux de travail HDX-MS ascendant fournit un nombre suffisant de peptides identifiés avec confiance qui couvrent la séquence protéique d’intérêt. En outre, HDX-MS peut fournir des informations sur la dynamique conformationnelle dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage protéique spécifique au site comme cela serait utilisé dans les études de fluorescence à moléculeunique 13, et il n’y a pas de limite de taille au complexe protéique ou protéique qui peut être étudié (ce qui rend difficiles des approches telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire [NMR])7,14. Enfin, des méthodes HDX-MS résolues dans le temps peuvent être utilisées pour étudier les protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont difficiles à étudier avec la cristallographie aux rayons X15,16,17,18. La principale limitation de HDX-MS est que les données sont de faible résolution structurelle. Les données HDX-MS sont utiles pour indiquer où la dynamique conformationnelle évolue et pour révéler des changements conformationnels couplés, mais elles ne fournissent pas souvent beaucoup d’informations sur le mécanisme moléculaire précis qui conduit au changement observé. Les progrès récents dans la combinaison des méthodes de dissociation de capture d’électrons avec les données de protéine HDX-MS se sont révélés prometteurs pour cartographier les sites d’échange aux résidus d’acides aminéssimples 19, mais le suivi des études biochimiques et structurelles sont encore souvent nécessaires pour fournir la clarté aux modèles structurels transmis par les données HDX-MS.

Ci-dessous, un protocole détaillé pour le développement d’un essai HDX-MS est présenté20. Les protocoles de préparation de l’échantillon présentés ci-dessous devraient être généralement applicables à toute protéine qui présente une bonne solubilité dans les tampons aqueux. Des méthodes de préparation d’échantillons plus spécialisées et des workflows HDX-MS sont disponibles pour les protéines que nécessaire en présence de détergent ou de phospholipides21,22,23,24. Les paramètres instrumentaux de collecte de données HDX-MS sont décrits pour un spectromètre de masse quadrupole haute résolution couplé au système de chromatographie liquide. Des données d’une complexité et d’une résolution similaires pourraient être recueillies sur l’un ou l’autre d’un certain nombre de systèmes de spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) disponibles dans le commerce. Des aspects clés du traitement des données à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce sont également fournis. Nous présentons également des lignes directrices pour la collecte et l’analyse des données qui sont conformes aux recommandations formulées par l’ensemble de la communauté HDX-MS12. Le protocole décrit est utilisé pour étudier les propriétés structurelles dynamiques de HalM2, une synthétase lanthipeptide qui catalyse la maturation en plusieurs étapes d’un produit naturel peptidique antimicrobien20. Nous montrons comment HDX-MS peut être utilisé pour révéler les sites de liaison du substrat et les propriétés allostériques qui ont échappé à la caractérisation précédente. Plusieurs autres protocoles sur la protéine HDX-MS ont été publiés ces dernières années25,26. Avec le présent travail, ces contributions antérieures devraient fournir au lecteur une certaine flexibilité dans la conception expérimentale.

Protocol

1. Préparation de réaccérateurs déréflés et de solutions de stock enzymatique Préparez les réachagents nécessaires aux réactions HDX (y compris les tampons, sels, substrats, ligands, etc.) sous forme de solutions de stock concentré 100−200x en D2O (99,9 % de fraction atome D). Préparez au moins 50 mL de solution de stock tampon.NOTE: Pour la caractérisation de HalM2, les solutions suivantes ont été préparées: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2 carboxyethyl)phosphine (TCEP)…

Representative Results

Il est nécessaire d’évaluer la qualité de la digestion protéolytique et la reproductibilité du flux de travail pour chaque ensemble d’injections d’échantillons. Ainsi, avant d’effectuer des essais HDX-MS, il est essentiel d’établir des conditions efficaces pour la protéolyse de la protéine d’intérêt, pour la séparation des peptides à l’aide de la chromatographie liquide de phase inverse et de la mobilité des ions de phase gazeuse, et pour la détection des peptides à l’aide de SP. À cette …

Discussion

Le flux de travail HDX-MS présenté dans ce protocole fournit une plate-forme remarquablement robuste pour cartographier la distribution spatiale des éléments structurellement dynamiques dans les protéines et pour étudier comment ces dynamiques changent en réponse à la perturbation (liaison ligand, mutagenèse enzymatique, etc.). HDX-MS présente plusieurs avantages distincts par rapport à d’autres approches de biologie structurelle qui sont couramment utilisées pour étudier la dynamique conformationnelle. Pl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, le Fonds de recherche du Québec nature et technologie, la Fondation canadienne pour l’innovation et les fonds de démarrage de l’Université McGill.

Materials

Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) BioBasic NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore) Milipore Sigma UFC501096
acetonitrile Fisher A955-1
AMP-PNP SIGMA A2647-25MG
ATP SIGMA a2383-5G
D2O ALDRICH 435767-100G
formic acid Thermo Fisher 28905
guanidine-HCl VWR 97063-764
HEPES Fisher BP310-1
Magnesium chloride SiGMA-Aldrich 63068-250G
Potassium chloride BioBasic PB0440
potassium phosphate BioBasic PB0445
TCEP Hydrochloride TRC Canada T012500 peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
software
Deuteros Andy M C Lau, et al version 1.08
DynamX Waters version 3.0
MassLynx Waters version 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)
Waters version 3.0.3
PyMOL Schrödinger version 2.2.2
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column Waters 186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column Waters 186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System Waters
HDX Manager Waters
microtip pH electrode Thermo Fisher 13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn Waters 186007233
Waters Synapt G2-Si Waters

References

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Cite This Article
Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes. J. Vis. Exp. (159), e61053, doi:10.3791/61053 (2020).

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