Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução
Summary
Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.
Abstract
O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.
Introduction
O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.
Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa1, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas 2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF2 . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.
A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico5. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN2), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se8 e Fe9 à temperatura criogênica.
Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.
Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.
Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é cr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo “grande emprunt” francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01-0008) e o projeto SEDMAC para apoio financeiro (INCA-Plan câncer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
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