高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製
Summary
このプロトコルは、シンクロトロンベースのX線吸収分光法実験のために生物学的クライオサンプルを調製するための詳細な手順を提示する。サンプル調製と凍結保存を最適化するために必要なすべてのステップを、がん細胞と植物プランクトン細胞を用いたプロトコルの例で説明します。この方法は、サンプルクライオ調製の普遍的な標準を提供します。
Abstract
X線吸収分光法(XAS)による元素の研究は、生物学的システムにおける金属の役割を研究する際に特に興味深い。サンプル調製は、特に生物学的サンプルにとって、重要でしばしば複雑な手順です。X線スペシエーション技術は広く使用されているが、詳細なプロトコルはまだこの技術のユーザに普及していない。さらに、化学状態の改変が懸念されており、細胞または組織の化学的完全性の最大の保存を提供するために、生物学的サンプルをほぼ天然の水和状態で分析するために、クライオベースの技術が推奨されます。ここでは、凍結保存試料に基づく細胞調製プロトコールを提案する。これは、癌細胞におけるセレンの高エネルギー分解能蛍光検出X線吸収分光法研究および植物プランクトン中の鉄の研究において実証されている。このプロトコルは、他の生物学的サンプルおよび照射によって損傷を受ける可能性のある他のX線技術と共に使用することができる。
Introduction
必須または毒性元素の細胞内変換の研究には、高感度のスペシエーション技術が必要であり、化学種の改変を受けやすいことが多いサンプル調製ステップを最小限に抑える必要があります。
セレンや鉄などの生理学的元素は、その複雑な化学的性質、セレンまたは鉄種の様々な安定性、およびppm(mg / kg)またはサブppm範囲でのそれらの低濃度のために、種分化することが特に困難であることが知られている。したがって、XASによるこれらの元素のスペシエーションの研究は、非常に困難な場合があります。シンクロトロンXAS、特に高エネルギー分解能蛍光検出XAS(HERFD-XAS)は、非常に低いシグナル対バックグラウンド比1を可能にし、シンクロトロン源で利用可能な、複雑な生物学的マトリックス2,3中の高度に希釈された元素をスペシエーションする。従来の蛍光XAS測定は、欧州放射光施設(ESRF)4のCRG-FAMEビームライン上で、エネルギー帯域幅約150~250eVのエネルギー分解固体検出器(SSD)を使用して実行できますが、HERFD-XAS測定には、ESRF2のCRG-FAME-UHDビームライン上で、約1~3eVのエネルギー帯域幅を持つ水晶分析器分光器(CAS)が必要です。.蛍光光子は、それぞれ電子的または光学的プロセスによってそれらのエネルギーに関して区別される。
サンプルクライオ調製は、構造を維持し、組成化学的完全性を維持するために不可欠であり、したがって、生物学的天然状態5に近い分析を可能にする。さらに、液体ヘリウム極低温冷却(LN2)を使用して10 Kという低い極低温で実施された分析により、放射線損傷が減速し、XASの元素スペシエーションが維持されます。生物学的試料に適用されたXAS技術に関するいくつかのレビューは、極低温条件下で試料を調製および分析する必要性を報告しているが(例えば、Sarretら6、Porcaro et al.7)、それらのどれも関連する詳細なプロトコルを明確に記述していない。この公報では、極低温でのSe8 およびFe9 のHERFD−XASスペシエーションについて、癌細胞およびプランクトン微生物の凍結調製方法が記載されている。
最先端のXAS分光法測定中のサンプル調製と環境のための良い習慣は、1)セットアップを必要とします。2)放射線障害の影響を可能な限り制限する分析手順。3)試料(またはモデル化合物参照)をX線光子ビームサイズに対してできるだけ均質にする。第1の項目は、液体ヘリウムクライオスタットを用いて低温で取得を行うことによって考慮される。第2の項目は、梁に対してそれを移動させることによってサンプルの新鮮な領域に対して各取得を行うことによって対処される。最後に、第3の条件を考慮すると、サンプル(ペレット)および参照(粉末)は、気孔率および不均一性を可能な限り制限し、X線プローブされたサンプル表面上のビームサイズに対する粗さを避けるために、プレスバルクペレットにコンディショニングされる。プロトコルがこれらすべての点をどのように処理するかを説明します。
ヒト前立腺細胞株PC-3(転移能が高い)と卵巣細胞株OVCAR-3(卵巣がん症例全体の最大70%を占める)を用いて、セレンナノ粒子(Se-NP)のがん細胞に対する抗増殖特性を調べ、モデル種として Phaeodactylum tricornutum Diatom をモデル種として、植物プランクトン中の鉄隔離を調べました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、X線吸収分光法によって生物学的サンプル中のセレンおよび鉄の化学的形態を研究するために使用された。これは、生物学的サンプルおよび参照化合物のクライオ調製および保管、ならびにHERFD-XAS測定に焦点を当てています。
クライオ調製および貯蔵
バルク生物学的試料ペレットの凍結調製は、試料中に存在する種の化学的完全性の保?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CEMHTI(フランス、オルレアン、ANR-13-BS08-0012-01)とラベックスOSUG@2020(フランス、グルノーブル、ANR-10-LABX-0056)によるビームライン開発への財政的貢献に感謝しています。FAME-UHDプロジェクトは、フランスの「グランド・エンプラント」EquipEx(EcoX、ANR-10-EQPX-27-01)、CEA-CNRS CRG コンソーシアム、INSU CNRS研究所によって財政的に支援されています。実験中のすべての貢献、特にBM30BとBM16に取り組んでいるすべての人に感謝しています。著者らは、放射光ビームタイムの提供に関する欧州放射光施設を認めている。我々はまた、財政支援のためのPHYTOMET ANRプロジェクト(ANR-16-CE01-0008)及び財政支援のためのSEDMACプロジェクト(INCA-Plan cancer-ASC16019CS)を認識する。
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
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