Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения
Summary
Этот протокол представляет собой подробную процедуру подготовки биологических криосамплей для экспериментов с рентгеновской абсорбционной спектроскопией на основе синхротронов. Мы описываем все шаги, необходимые для оптимизации пробоподготовки и криоконсервации, с примерами протокола с раковыми и фитопланктонными клетками. Этот метод обеспечивает универсальный стандарт криоподготовки образцов.
Abstract
Изучение элементов с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии (ХАС) представляет особый интерес при изучении роли металлов в биологических системах. Пробоподготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для биологических образцов. Хотя методы рентгеновского видообразования широко используются, подробный протокол еще не был распространен среди пользователей этого метода. Кроме того, модификация химического состояния вызывает беспокойство, и криотехнологии рекомендуются для анализа биологических образцов в их почти нативном гидратированном состоянии, чтобы обеспечить максимальное сохранение химической целостности клеток или тканей. Здесь мы предлагаем протокол клеточной подготовки, основанный на крио-сохраненных образцах. Это проявляется в флуоресцентном рентгеновском спектроскопическом исследовании селена в раковых клетках с высоким разрешением флуоресценции и исследовании железа в фитопланктоне. Этот протокол может быть использован с другими биологическими образцами и другими рентгеновскими методами, которые могут быть повреждены облучением.
Introduction
Изучение клеточных биотрансформаций эссенциальных или токсичных элементов требует методов видообразования с высокой чувствительностью и должно свести к минимуму этапы подготовки образцов, которые часто склонны к модификации химических веществ.
Физиологические элементы, такие как селен и железо, как известно, особенно трудно видообразование из-за их сложного химического состава, различных стабильностей видов селена или железа и их низкой концентрации в диапазоне ppm (мг / кг) или даже ниже ppm. Таким образом, изучение видообразования этих элементов С помощью XAS может быть чрезвычайно сложным. Синхротронный XAS и особенно флуоресцентный XAS с высоким энергетическим разрешением (HERFD-XAS), который допускает очень низкое отношение сигнал/фон1, доступны на синхротронных источниках для видообразования сильно разбавленных элементов в сложных биологических матрицах 2,3. Обычные измерения флуоресценции-XAS могут быть выполнены с использованием твердотельного детектора с энергетическим разрешением (SSD) с полосой пропускания энергии ~ 150-250 эВ, на лучевой линии CRG-FAME в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF)4, в то время как для измерений HERFD-XAS требуется спектрометр кристаллического анализатора (CAS) с полосой пропускания энергии ~ 1-3 эВ, на лучевой линии CRG-FAME-UHD на ESRF2 . Флуоресцентные фотоны различаются по отношению к их энергии с помощью электронных или оптических процессов соответственно.
Криоподготовка образца необходима для сохранения структур и поддержания композиционной химической целостности, что позволяет проводить анализ вблизи биологического нативного состояния5. Кроме того, анализы, выполняемые при криогенных температурах до 10 К с использованием криогенного охлаждения жидкого гелия (LN2), позволяют радиационному повреждению замедлить и сохранить элементарное видообразование для XAS. Хотя в некоторых обзорах методов XAS, применяемых к биологическим образцам, сообщается о необходимости подготовки и анализа образцов в криогенных условиях (например, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ни один из них четко не описывает соответствующий подробный протокол. В данной публикации описан способ криопрепарации раковых клеток и планктонных микроорганизмов для HERFD-XAS видообразования Se8 и Fe9 при криогенной температуре.
Надлежащая практика подготовки образцов и окружающей среды во время современных измерений XAS-спектроскопии требует 1) настройки; 2) процедура анализа, максимально ограничивающая последствия радиационного повреждения; и 3) образец (или эталонное соединение модели) как можно более однородный по отношению к размеру пучка рентгеновских фотонов. Первый пункт учитывается при выполнении сбора при низкой температуре, с использованием жидкого криостата гелия. Второй пункт решается путем выполнения каждого захвата на свежем участке образца путем перемещения его относительно луча. Наконец, учитывая третье условие, образцы (гранулы) и референции (порошки) кондиционируются в прессованных объемных гранулах, чтобы максимально ограничить пористость и неоднородность и избежать шероховатости по отношению к размеру пучка на поверхности исследуемого рентгеновского образца. Мы объясняем, как протокол решает все эти вопросы.
Мы использовали клеточную линию предстательной железы человека PC-3 (высокий метастатический потенциал) и клеточную линию яичников OVCAR-3 (на которую приходится до 70% всех случаев рака яичников) для исследования антипролиферативных свойств по отношению к раковым клеткам наночастиц селена (Se-NPs) и Phaeodactylum tricornutum diatom в качестве модельного вида для исследования секвестрации железа в фитопланктоне.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол использовался для изучения химической формы селена и железа в биологических образцах с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии. Основное внимание уделяется криоподготовке и хранению биологических образцов и эталонных соединений, а также измерениям HERFD-XAS.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за финансовый вклад в разработку линии луча CEMHTI (Орлеан, Франция, ANR-13-BS08-0012-01) и Labex OSUG@2020 (Гренобль, Франция, ANR-10-LABX-0056). Проект FAME-UHD финансово поддерживается французским «grand emprunt» EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), консорциумом CEA-CNRS CRG и институтом INSU CNRS. Мы благодарны за все вклады во время экспериментов, особенно всех людей, работающих над BM30B и BM16. Авторы признают Европейскую установку синхротронного излучения для обеспечения времени пучка синхротронного излучения. Мы также признаем проект PHYTOMET ANR для финансовой поддержки (ANR-16-CE01-0008) и проект SEDMAC для финансовой поддержки (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
