Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione
Summary
Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare criocampioni biologici per esperimenti di spettroscopia di assorbimento dei raggi X basati su sincrotrone. Descriviamo tutti i passaggi necessari per ottimizzare la preparazione del campione e la crioconservazione con esempi del protocollo con cellule tumorali e fitoplancton. Questo metodo fornisce uno standard universale di crio-preparazione del campione.
Abstract
Lo studio degli elementi con spettroscopia di assorbimento dei raggi X (XAS) è di particolare interesse quando si studia il ruolo dei metalli nei sistemi biologici. La preparazione dei campioni è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per i campioni biologici. Sebbene le tecniche di speciazione a raggi X siano ampiamente utilizzate, nessun protocollo dettagliato è stato ancora diffuso per gli utenti della tecnica. Inoltre, la modifica dello stato chimico è preoccupante e si raccomandano tecniche basate sulla criografia per analizzare i campioni biologici nel loro stato idrato quasi nativo per fornire la massima conservazione dell’integrità chimica delle cellule o dei tessuti. Qui, proponiamo un protocollo di preparazione cellulare basato su campioni crioconservati. È dimostrato in uno studio di spettroscopia di assorbimento a raggi X rilevato ad alta risoluzione energetica con fluorescenza del selenio nelle cellule tumorali e in uno studio sul ferro nel fitoplancton. Questo protocollo può essere utilizzato con altri campioni biologici e altre tecniche a raggi X che possono essere danneggiate dall’irradiazione.
Introduction
Lo studio delle biotrasformazioni cellulari di elementi essenziali o tossici richiede tecniche di speciazione ad alta sensibilità e dovrebbe ridurre al minimo le fasi di preparazione del campione che sono spesso inclini alla modifica di specie chimiche.
Elementi fisiologici come il selenio e il ferro sono noti per essere particolarmente difficili da speciare a causa della loro chimica complessa, delle varie stabilità delle specie di selenio o ferro e della loro bassa concentrazione nell’intervallo ppm (mg / kg) o anche sub-ppm. Pertanto, lo studio della speciazione di questi elementi da parte di XAS può essere estremamente impegnativo. Il sincrotrone XAS e in particolare l’XAS di fluorescenza ad alta risoluzione energetica (HERFD-XAS), che consente un rapporto segnale-sfondomolto basso 1, sono disponibili presso sorgenti di sincrotrone per speciare elementi altamente diluiti in matrici biologiche complesse 2,3. Le misurazioni convenzionali di fluorescenza-XAS possono essere eseguite utilizzando un rivelatore a stato solido (SSD) a risoluzione di energia con una larghezza di banda di energia ~ 150-250 eV, sulla beamline CRG-FAME presso l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mentre le misurazioni HERFD-XAS richiedono uno spettrometro analizzatore di cristalli (CAS), con una larghezza di banda di energia ~ 1-3 eV, sulla beamline CRG-FAME-UHD presso l’ESRF2 . I fotoni a fluorescenza sono discriminati rispetto alla loro energia rispettivamente con processi elettronici o ottici.
La crio-preparazione del campione è essenziale per preservare le strutture e mantenere l’integrità chimica compositiva, consentendo così un’analisi vicina allo stato biologico nativo5. Inoltre, le analisi eseguite a temperature criogeniche fino a 10 K utilizzando il raffreddamento criogenico ad elio liquido (LN2), consentono ai danni da radiazioni di rallentare e preservare la speciazione elementare per XAS. Sebbene alcune revisioni sulle tecniche XAS applicate ai campioni biologici riportino la necessità di preparare e analizzare campioni in condizioni criogeniche (ad esempio, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nessuna di esse descrive chiaramente il relativo protocollo dettagliato. In questa pubblicazione, viene descritto un metodo per la crio-preparazione delle cellule tumorali e dei microrganismi plancton per la speciazione HERFD-XAS di Se8 e Fe9 a temperatura criogenica.
Le buone pratiche per la preparazione dei campioni e l’ambiente durante le misurazioni della spettroscopia XAS all’avanguardia richiedono 1) una configurazione; 2) una procedura di analisi che limiti il più possibile gli effetti dei danni da radiazioni; e 3) un campione (o modello di riferimento composto) il più omogeneo possibile rispetto alla dimensione del fascio di fotoni a raggi X. Il primo elemento viene preso in considerazione eseguendo l’acquisizione a bassa temperatura, utilizzando un criostato di elio liquido. Il secondo punto viene affrontato eseguendo ogni acquisizione su una nuova area del campione spostandolo rispetto alla trave. Infine, considerando la terza condizione, i campioni (pellet) e i riferimenti (polveri) sono condizionati in pellet sfusi pressati al fine di limitare il più possibile porosità e disomogeneità ed evitare rugosità rispetto alla dimensione del fascio sulla superficie del campione sondato a raggi X. Spieghiamo come il protocollo affronta tutti questi punti.
Abbiamo utilizzato la linea cellulare della prostata umana PC-3 (alto potenziale metastatico) e la linea cellulare ovarica OVCAR-3 (che rappresenta fino al 70% di tutti i casi di cancro ovarico) per studiare le proprietà antiproliferative verso le cellule tumorali delle nanoparticelle di selenio (Se-NP) e la diatomea Phaeodactylum tricornutum come specie modello per studiare il sequestro del ferro nel fitoplancton.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato utilizzato per studiare la forma chimica del selenio e del ferro in campioni biologici mediante spettroscopia di assorbimento dei raggi X. Si concentra sulla crio-preparazione e conservazione di campioni biologici e composti di riferimento, nonché sulle misurazioni HERFD-XAS.
Crio-preparazione e conservazione
La crio-preparazione dei pellet di campioni biologici sfusi consente di preservare l’integrità chimica delle specie presenti nei campioni….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per i contributi finanziari allo sviluppo della beamline da parte di CEMHTI (Orleans, Francia, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francia, ANR-10-LABX-0056). Il progetto FAME-UHD è sostenuto finanziariamente dal “grand emprunt” francese EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), dal consorzio CEA-CNRS CRG e dall’istituto INSU CNRS. Siamo grati di tutti i contributi durante gli esperimenti, in particolare di tutte le persone che lavorano su BM30B e BM16. Gli autori riconoscono l’European Synchrotron Radiation Facility per la fornitura di beamtime di radiazione di sincrotrone. Riconosciamo anche il progetto PHYTOMET ANR per il sostegno finanziario (ANR-16-CE01-0008) e il progetto SEDMAC per il sostegno finanziario (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
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