הכנת דגימות ביולוגיות לספקולציה בטמפרטורה קריוגנית באמצעות ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה
Summary
פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת קריאוסמפלים ביולוגיים לניסויים ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן מבוססי סינכרוטרון. אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים כדי לייעל את הכנת הדגימה ואת שימור ההקפאה באמצעות דוגמאות של הפרוטוקול עם תאי סרטן ופיטופלנקטון. שיטה זו מספקת תקן אוניברסלי של הכנת קריו לדוגמה.
Abstract
חקר היסודות עם ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן (XAS) מעניין במיוחד כאשר חוקרים את תפקידן של מתכות במערכות ביולוגיות. הכנת דגימות היא הליך מפתח ולעתים קרובות מורכב, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. למרות שטכניקות צפייה ברנטגן נמצאות בשימוש נרחב, עדיין לא הופץ פרוטוקול מפורט למשתמשים בטכניקה. יתר על כן, שינוי מצב כימי הוא מדאיג, וטכניקות מבוססות cryo מומלץ לנתח את הדגימות הביולוגיות במצב הידרציה כמעט ילידי שלהן כדי לספק את השימור המרבי של שלמות כימית של התאים או הרקמות. כאן אנו מציעים פרוטוקול הכנה תאית המבוסס על דגימות שהשתמרו ב-cryo. הוא מודגם במחקר ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן של סלניום בתאים סרטניים ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה של אנרגיה, ובמחקר של ברזל בפיטופלנקטון. פרוטוקול זה יכול לשמש עם דגימות ביולוגיות אחרות וטכניקות רנטגן אחרות שעלולות להיפגע על ידי הקרנה.
Introduction
המחקר של ביו-טרנספורמציות תאיות של יסודות חיוניים או רעילים דורש טכניקות ספקולציה עם רגישות גבוהה ואמור למזער את שלבי הכנת הדגימה שלעתים קרובות נוטים לשינוי של מינים כימיים.
יסודות פיזיולוגיים כמו סלניום וברזל ידועים כקשים במיוחד לחיזוי בשל הכימיה המורכבת שלהם, תנוחות שונות של מיני הסלניום או הברזל, והריכוז הנמוך שלהם ב-ppm (mg/kg) או אפילו בתת-ppm. לפיכך, המחקר של speciation של אלמנטים אלה על ידי XAS יכול להיות מאתגר ביותר. סינכרוטרון XAS ובמיוחד פלואורסצנציה ברזולוציה אנרגטית גבוהה שזוהתה XAS (HERFD-XAS), המאפשרת יחס אות-לרקע נמוך מאוד1, זמינים במקורות סינכרוטרון כדי לחזות אלמנטים מדוללים מאוד במטריצות ביולוגיות מורכבות 2,3. מדידות פלואורסצנציה-XAS קונבנציונליות יכולות להתבצע באמצעות גלאי מצב מוצק (SSD) עם רוחב פס אנרגיה ~150-250 eV, על קו הקרן CRG-FAME במתקן הקרינה האירופי סינכרוטרון (ESRF)4, בעוד שמדידות HERFD-XAS זקוקות לספקטרומטר מנתח גבישים (CAS), עם רוחב פס אנרגיה ~1-3 eV, על קו הקרן CRG-FAME-UHD ב- ESRF2 . פוטונים פלואורסצנטיים מופלים ביחס לאנרגיה שלהם באמצעות תהליכים אלקטרוניים או אופטיים בהתאמה.
הכנת הקריו-דגימה חיונית כדי לשמר מבנים ולשמור על שלמות כימית קומפוזיציונית, ובכך לאפשר ניתוח קרוב למצב הטבעי הביולוגי5. יתר על כן, ניתוחים שבוצעו בטמפרטורות קריוגניות נמוכות עד כדי 10 K באמצעות קירור קריוגני הליום נוזלי (LN2), מאפשרים לנזקי קרינה להאט ולשמר את הספקולציה היסודית עבור XAS. למרות שסקירות מסוימות על טכניקות XAS המיושמות על דגימות ביולוגיות מדווחות על הצורך להכין ולנתח דגימות בתנאים קריוגניים (למשל, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), אף אחת מהן אינה מתארת בבירור את הפרוטוקול המפורט הקשור. בפרסום זה, שיטה להכנת קריו של תאים סרטניים ומיקרואורגניזמים פלנקטון מתוארת עבור HERFD-XAS speciation של Se8 ו- Fe9 בטמפרטורה קריוגנית.
תרגול טוב להכנת דגימה וסביבה במהלך מדידות ספקטרוסקופיה XAS חדישות דורשות 1) התקנה; 2) הליך ניתוח המגביל ככל האפשר את השפעות נזקי הקרינה; ו-3) מדגם (או ייחוס תרכובת מודל) הומוגני ככל האפשר ביחס לגודל קרן הפוטונים של קרני הרנטגן. הפריט הראשון נלקח בחשבון על ידי ביצוע הרכישה בטמפרטורה נמוכה, באמצעות קריוסטאט הליום נוזלי. הפריט השני מטופל על ידי ביצוע כל רכישה על שטח טרי של הדגימה על ידי הזזתו ביחס לקורה. לבסוף, בהתחשב במצב השלישי, דגימות (גלולות) והפניות (אבקות) מותנות בכדורי תפזורת לחוצים על מנת להגביל את הנקבוביות ואת אי-ההומוגניות ככל האפשר, וכדי למנוע חספוס ביחס לגודל הקרן על משטח הדגימה הנבדק בקרן רנטגן. אנו מסבירים כיצד הפרוטוקול מתמודד עם כל הנקודות הללו.
השתמשנו בקו תאי הערמונית האנושיים PC-3 (פוטנציאל גרורתי גבוה) ובקו תאי השחלות OVCAR-3 (המהווה עד 70% מכלל מקרי סרטן השחלות) כדי לחקור את התכונות האנטי-פרוליפרטיביות כלפי תאים סרטניים של ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), ו-Phaeodactylum tricornutum diatom כמין מודל לחקר רצף הברזל בפיטופלנקטון.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה שימש לחקר הצורה הכימית של סלניום וברזל בדגימות ביולוגיות על ידי ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן. הוא מתמקד בהכנת קריו ואחסון של דגימות ביולוגיות ותרכובות ייחוס, כמו גם במדידות HERFD-XAS.
הכנת קריו ואחסון
הכנת הקריו של כדורי הדגימה הביולוגית בתפזורת מאפש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על התרומות הכספיות לפיתוח קו הקרן על ידי CEMHTI (אורלינס, צרפת, ANR-13-BS08-0012-01) ו- Labex OSUG@2020 (גרנובל, צרפת, ANR-10-LABX-0056). פרויקט FAME-UHD נתמך כספית על ידי “האמפרנט הגדול” הצרפתי EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), קונסורציום CEA-CNRS CRG ומכון INSU CNRS. אנו אסירי תודה על כל התרומות במהלך הניסויים ובמיוחד על כל האנשים שעבדו על BM30B ו- BM16. המחברים מכירים במתקן הקרינה האירופי של סינכרוטרון למתן זמן קרן קרינה של קרינת סינכרוטרון. אנו מכירים גם בפרויקט PHYTOMET ANR לתמיכה כספית (ANR-16-CE01-0008) ובפרויקט SEDMAC לתמיכה כספית (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
