Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie
Summary
Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om biologische cryosamples voor synchrotron-gebaseerde röntgenabsorptiespectroscopie-experimenten voor te bereiden. We beschrijven alle stappen die nodig zijn om de monstervoorbereiding en cryopreservatie te optimaliseren met voorbeelden van het protocol met kanker- en fytoplanktoncellen. Deze methode biedt een universele standaard voor cryo-voorbereiding van monsters.
Abstract
De studie van elementen met röntgenabsorptiespectroscopie (XAS) is van bijzonder belang bij het bestuderen van de rol van metalen in biologische systemen. Monstervoorbereiding is een belangrijke en vaak complexe procedure, met name voor biologische monsters. Hoewel röntgenspeciatietechnieken veel worden gebruikt, is er nog geen gedetailleerd protocol verspreid voor gebruikers van de techniek. Verder is chemische toestandsmodificatie van belang en worden cryo-gebaseerde technieken aanbevolen om de biologische monsters in hun bijna-inheemse gehydrateerde toestand te analyseren om het maximale behoud van de chemische integriteit van de cellen of weefsels te bieden. Hier stellen we een cellulair voorbereidingsprotocol voor op basis van cryo-geconserveerde monsters. Het wordt aangetoond in een hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerdE röntgenabsorptie spectroscopie studie van selenium in kankercellen en een studie van ijzer in fytoplankton. Dit protocol kan worden gebruikt met andere biologische monsters en andere röntgentechnieken die door bestraling kunnen worden beschadigd.
Introduction
De studie van de cellulaire biotransformaties van essentiële of toxische elementen vereist soortvormingstechnieken met een hoge gevoeligheid en moet monstervoorbereidingsstappen minimaliseren die vaak vatbaar zijn voor modificatie van chemische soorten.
Fysiologische elementen zoals selenium en ijzer staan erom bekend bijzonder moeilijk te specificeren zijn vanwege hun complexe chemie, verschillende stabiliteiten van de selenium- of ijzersoorten en hun lage concentratie in het ppm (mg / kg) of zelfs sub-ppm-bereik. De studie van de soortvorming van deze elementen door XAS kan dus uiterst uitdagend zijn. Synchrotron XAS en met name hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerde XAS (HERFD-XAS), die een zeer lage signaal-tot-achtergrondverhouding1 mogelijk maakt, zijn beschikbaar bij synchrotronbronnen om sterk verdunde elementen in complexe biologische matrices te speciëren 2,3. Conventionele fluorescentie-XAS-metingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een energy resolved solid state detector (SSD) met een energiebandbreedte ~ 150-250 eV, op de CRG-FAME-bundellijn bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, terwijl HERFD-XAS-metingen een kristalanalysatorspectrometer (CAS) nodig hebben, met een energiebandbreedte ~ 1-3 eV, op de CRG-FAME-UHD-bundellijn op de ESRF2 . Fluorescentiefotonen worden gediscrimineerd met betrekking tot hun energie met respectievelijk elektronische of optische processen.
De cryopreparaat van het monster is essentieel om structuren te behouden en de chemische integriteit van de samenstelling te behouden, waardoor analyse dicht bij de biologische inheemse toestand5 mogelijk is. Bovendien zorgen analyses uitgevoerd bij cryogene temperaturen zo laag als 10 K met behulp van vloeibare helium cryogene koeling (LN2), ervoor dat stralingsschade vertraagt en elementaire speciatie voor XAS behoudt. Hoewel sommige beoordelingen van XAS-technieken toegepast op biologische monsters de noodzaak melden om monsters in cryogene omstandigheden voor te bereiden en te analyseren (bijv. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschrijft geen van hen duidelijk het gerelateerde gedetailleerde protocol. In deze publicatie wordt een methode beschreven voor cryo-voorbereiding van kankercellen en planktonmicro-organismen voor HERFD-XAS-speciatie van Se8 en Fe9 bij cryogene temperatuur.
Goede praktijken voor monstervoorbereiding en omgeving tijdens state-of-the-art XAS-spectroscopiemetingen vereisen 1) een opstelling; 2) een analyseprocedure die de effecten van stralingsschade zoveel mogelijk beperkt; en 3) een monster (of model samengestelde referentie) dat zo homogeen mogelijk is ten opzichte van de bundelgrootte van röntgenfotonen. Het eerste item wordt in aanmerking genomen door de acquisitie bij een lage temperatuur uit te voeren, met behulp van een vloeibare helium cryostaat. Het tweede item wordt behandeld door elke acquisitie uit te voeren op een vers deel van het monster door het ten opzichte van de balk te verplaatsen. Ten slotte worden, rekening houdend met de derde voorwaarde, monsters (pellets) en referenties (poeders) geconditioneerd in geperste bulkpellets om porositeiten en inhomogeniteiten zoveel mogelijk te beperken en ruwheid te voorkomen met betrekking tot de bundelgrootte op het oppervlak van het röntgensonde monster. We leggen uit hoe het protocol met al deze punten omgaat.
We gebruikten menselijke prostaatcellijn PC-3 (hoog gemetastaseerd potentieel) en ovariumcellijn OVCAR-3 (die goed is voor maximaal 70% van alle gevallen van eierstokkanker) om de antiproliferatieve eigenschappen ten opzichte van kankercellen van selenium nanodeeltjes (Se-NP’s) en Phaeodactylum tricornutum diatomeeën te onderzoeken als een modelsoort om ijzervastlegging in fytoplankton te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol werd gebruikt om de chemische vorm van selenium en ijzer in biologische monsters te bestuderen door middel van röntgenabsorptiespectroscopie. Het richt zich op de cryo-voorbereiding en opslag van biologische monsters en referentieverbindingen, evenals op de HERFD-XAS-metingen.
Cryo-voorbereiding en opslag
De cryo-voorbereiding van de bulk biologische monsterkorrels maakt het mogelijk om de chemische integriteit van de in de monsters aanwezige soorten te behoud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de financiële bijdragen aan de ontwikkeling van de beamline door CEMHTI (Orleans, Frankrijk, ANR-13-BS08-0012-01) en Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrijk, ANR-10-LABX-0056). Het FAME-UHD-project wordt financieel ondersteund door het Franse “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), het CEA-CNRS CRG-consortium en het INSU CNRS-instituut. We zijn dankbaar voor alle bijdragen tijdens de experimenten, vooral alle personen die aan BM30B en BM16 werken. De auteurs erkennen de European Synchrotron Radiation Facility voor het leveren van synchrotron stralingsbundeltijd. We erkennen ook het PHYTOMET ANR-project voor financiële steun (ANR-16-CE01-0008) en het SEDMAC-project voor financiële steun (INCA-Plan kanker-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
