تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية
Summary
يقدم هذا البروتوكول إجراء مفصلا لإعداد عينات التبريد البيولوجية لتجارب التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية القائمة على السنكروترون. نحن نصف جميع الخطوات المطلوبة لتحسين إعداد العينات والحفظ بالتبريد مع أمثلة على البروتوكول مع خلايا السرطان والعوالق النباتية. توفر هذه الطريقة معيارا عالميا لإعداد العينات بالتبريد.
Abstract
إن دراسة العناصر ذات التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية (XAS) ذات أهمية خاصة عند دراسة دور المعادن في النظم البيولوجية. يعد تحضير العينات إجراء رئيسيا وغالبا ما يكون معقدا ، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية. وعلى الرغم من أن تقنيات انتواع الأشعة السينية تستخدم على نطاق واسع، لم يتم بعد نشر أي بروتوكول مفصل لمستخدمي هذه التقنية. علاوة على ذلك ، فإن تعديل الحالة الكيميائية أمر مثير للقلق ، ويوصى بالتقنيات القائمة على التبريد لتحليل العينات البيولوجية في حالتها المائية شبه الأصلية لتوفير أقصى قدر من الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا أو الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكول إعداد خلوي يعتمد على العينات المحفوظة بالتبريد. ويتضح ذلك في التألق عالي الدقة للطاقة الذي تم الكشف عنه دراسة طيفية لامتصاص الأشعة السينية للسيلينيوم في الخلايا السرطانية ودراسة للحديد في العوالق النباتية. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع عينات بيولوجية أخرى وتقنيات الأشعة السينية الأخرى التي يمكن أن تتضرر من التشعيع.
Introduction
تتطلب دراسة التحولات الحيوية الخلوية للعناصر الأساسية أو السامة تقنيات انتواع ذات حساسية عالية ويجب أن تقلل إلى أدنى حد من خطوات إعداد العينات التي غالبا ما تكون عرضة لتعديل الأنواع الكيميائية.
من المعروف أن العناصر الفسيولوجية مثل السيلينيوم والحديد يصعب تحديدها بشكل خاص بسبب كيمياءها المعقدة ، والثبات المختلفة لأنواع السيلينيوم أو الحديد ، وتركيزها المنخفض في نطاق جزء في المليون (مغ / كغ) أو حتى دون جزء في المليون. وبالتالي ، فإن دراسة انتواع هذه العناصر بواسطة XAS يمكن أن تكون صعبة للغاية. السنكروترون XAS وخاصة التألق عالي الدقة للطاقة المكتشف XAS (HERFD-XAS) ، والذي يسمح بنسبة إشارة إلى خلفية منخفضة للغاية1 ، متوفرة في مصادر السنكروترون لتحديد العناصر المخففة للغاية في المصفوفات البيولوجية المعقدة 2,3. يمكن إجراء قياسات التألق XAS التقليدية باستخدام كاشف الحالة الصلبة المحلولة للطاقة (SSD) مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 150-250 eV ، على خط شعاع CRG-FAME في المرفق الأوروبي لإشعاع السنكروترون (ESRF)4 ، في حين تحتاج قياسات HERFD-XAS إلى مطياف محلل البلورات (CAS) ، مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 1-3 eV ، على خط شعاع CRG-FAME-UHD في ESRF2 . يتم تمييز الفوتونات الفلورية فيما يتعلق بطاقتها مع العمليات الإلكترونية أو البصرية على التوالي.
يعد تحضير العينة بالتبريد ضروريا للحفاظ على الهياكل والحفاظ على السلامة الكيميائية التركيبية ، مما يسمح بالتحليل بالقرب من الحالة البيولوجية الأصلية5. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات التي تجرى في درجات حرارة مبردة تصل إلى 10 كلفن باستخدام التبريد المبرد بالهيليوم السائل (LN2)، تسمح للضرر الإشعاعي بالتباطؤ وتحافظ على الانتواع الأولي ل XAS. على الرغم من أن بعض المراجعات حول تقنيات XAS المطبقة على العينات البيولوجية تفيد بضرورة إعداد وتحليل العينات في الظروف المبردة (على سبيل المثال ، Sarret et al.6 و Porcaro et al.7) ، إلا أن أيا منها لا يصف بوضوح البروتوكول التفصيلي ذي الصلة. في هذا المنشور ، يتم وصف طريقة للتحضير المبرد للخلايا السرطانية والكائنات الحية الدقيقة للعوالق لانتواع HERFD-XAS ل Se8 و Fe9 في درجة حرارة مبردة.
تتطلب الممارسة الجيدة لإعداد العينات والبيئة أثناء قياسات التحليل الطيفي XAS الحديثة 1) إعدادا ؛ 2) إجراء تحليل يحد من آثار الضرر الإشعاعي قدر الإمكان ؛ و 3) عينة (أو مرجع مركب نموذجي) متجانسة قدر الإمكان فيما يتعلق بحجم شعاع فوتونات الأشعة السينية. يؤخذ العنصر الأول في الاعتبار عن طريق إجراء عملية الاستحواذ عند درجة حرارة منخفضة ، باستخدام كريوستات الهيليوم السائل. يتم التعامل مع البند الثاني من خلال تنفيذ كل عملية اقتناء على مساحة جديدة من العينة عن طريق تحريكها فيما يتعلق بالشعاع. وأخيرا، وبالنظر إلى الشرط الثالث، فإن العينات (الكريات) والمراجع (المساحيق) مشروطة في كريات سائبة مضغوطة من أجل الحد من المساميات وعدم التجانس قدر الإمكان، وتجنب الخشونة فيما يتعلق بحجم الحزمة على سطح العينة الذي تم فحصه بالأشعة السينية. نوضح كيف يتعامل البروتوكول مع كل هذه النقاط.
استخدمنا خط خلايا البروستاتا البشرية PC-3 (إمكانات نقيلي عالية) وخط خلية المبيض OVCAR-3 (الذي يمثل ما يصل إلى 70٪ من جميع حالات سرطان المبيض) للتحقيق في الخصائص المضادة للتكاثر تجاه الخلايا السرطانية لجسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) ، و Phaeodactylum tricornutum diatom كنوع نموذجي للتحقيق في عزل الحديد في العوالق النباتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة الشكل الكيميائي للسيلينيوم والحديد في العينات البيولوجية عن طريق التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية. وهو يركز على إعداد وتخزين العينات البيولوجية والمركبات المرجعية بالتبريد ، وكذلك على قياسات HERFD-XAS.
إعداد التبريد وتخزينه
ي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للمساهمات المالية في تطوير خط الشعاع من قبل CEMHTI (أورليانز ، فرنسا ، ANR-13-BS08-0012-01) و Labex OSUG@2020 (غرونوبل ، فرنسا ، ANR-10-LABX-0056). يتم دعم مشروع FAME-UHD ماليا من قبل EquipEx الفرنسية “Grand emprunt” (EcoX ، ANR-10-EQPX-27-01) ، واتحاد CEA-CNRS CRG ومعهد INSU CNRS. نحن ممتنون لجميع المساهمات خلال التجارب وخاصة جميع الأشخاص الذين يعملون على BM30B و BM16. يعترف المؤلفون بأن المرفق الأوروبي للإشعاع السنكروتروني يوفر وقت شعاع إشعاع السنكروترون. كما نعترف بمشروع PHYTOMET ANR للدعم المالي (ANR-16-CE01-0008) ومشروع SEDMAC للدعم المالي (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018)
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- SSHADE: “Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise” and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: https://www.sshade.eu/ (2018)
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019)
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
