שורש שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך בתוך הטאררי כוסמת (Fagopyrum טאטארנום)
Summary
אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.
Abstract
כוסמת טרארי (שחפת) ( ליטר) Gaertn בעלת פעילות ביולוגית ופרמקולוגית שונים, משום שהוא מכיל מטבוליטים משניים שופע כגון פלבנואידים, במיוחד rutin. Agrobacterium בשימוש בהדרגה ברחבי העולם כדי לגרום שורשים שעירים צמחי מרפא לחקור פונקציות גן ולהגדיל את התשואה של מטבוליטים משנית. במחקר זה, תיארנו שיטה מפורטת ליצירת . ריזוגנים-תיווך שורשיםשעירים בשחפת. Cotyledons וציר hypocotyledonary ב 7 – 10 ימים נבחרו כאקסוצמחים ונגועים עם . ריזוזוגנים נושאת וקטור בינארי, אשר המושרה שורשים השעירים האדוקיות שהופיעו לאחר 1 שבוע. השינוי שנוצר שורש השורש זוהה על בסיס מורפולוגיה, בחירת התנגדות (kanamycin), וביטוי גן העיתונאי (חלבון פלורסנט ירוק). לאחר מכן, השורשים השעירים הפכו את עצמם כנדרש. בינתיים, מיאלואובלסטוזיס (MYB) שעתוק גורם, FtMYB116, הפכה הגנום שחפת באמצעות א. ריזוזוגנים-תיווך השורשים שעירים כדי לאמת את התפקיד של FtMYB116 ב סינתזה פלאונואידים. התוצאות הראו כי הביטוי של גנים הקשורים פלונואיד ואת התשואה של תרכובות פלונואיד (rutin ו-quercetin) היו באופן משמעותי (p < 0.01) קידם על ידי FtMYB116, המציין כי . ריזוזוגנים-תיווך שורשים שעירים יכול לשמש כלי אלטרנטיבי יעיל לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משנית. פרוטוקול צעד אחר צעד המפורט במחקר זה ליצירת שורשים שעירים יכול להיות מאומץ לכל שינוי גנטי או צמחי מרפא אחרים לאחר הסתגלות.
Introduction
כוסמתטרטרית ( ליטר) הוא סוג של דו-פסיגיים השייך לסוג fagopyrum והמשפחה המאירוניים1בתוך השנה. כסוג של הרפואה הסינית מזון הומוולוגי, TB קיבל עניין רב בשל ההרכב הכימי הייחודי שלה ופעילויות ביוקליות מגוונות נגד מחלות. TB הוא עשיר בעיקר בפחמימות, חלבונים, ויטמינים, קרוטנואידים כמו גם ב פוליפנולים כגון חומצות פנופילית ו פלבנואידים1. פעילויות ביולוגיות ותרופתי שונות של פלונונואידים, כולל אנטיחמצוני, אנטי יתר לחץ דם2, אנטי דלקתיות, כמו גם antioxidative ותכונות נוגדות סוכרת, הוכחו3.
Agrobacterium ריזוגנס הוא חיידק האדמה תורמת לפיתוח של מחלת שורש שעירים בכמה צמחים גבוהים, במיוחד dicotyledons, על ידי זיהום אתרי הפצע4,5. תהליך זה הוא יזם על ידי העברת ה-DNA ב-לגרימת שורש (Ri) פלמיד5,6 והוא מלווה בדרך כלל על ידי שילוב וביטוי של גן אקסוגני מן הפלביניים Ri ואת השלבים הבאים של יצירת השורש השעיר פנוטיפ7. א. ריזוגנים-שורשים שעירים מתווכת, ככלי רב-עוצמה בתחום ביוטכנולוגיה הצמח, השתמשו באופן נרחב ביותר בשל הפרודוקטיביות היציבה והגבוהה שלהם ובידור קל בתקופה קצרה. יתר על כן, שורשים שעירים הנגרמת על ידי. ריזוזוגנים מכובד ביעילות על ידי פיתוח שורש plagiotropic שלהם וצמיחה מסעף מאוד בינונית ללא הורמון8. ניתן להשתמש בהם במספר תחומים של מחקר, כולל ייצור זרעים מלאכותיים, מחקר גולה שורש, ובלימוד האינטראקציות עם אורגניזמים אחרים כגון פטריות mycorrhizal, nematodes, ופתוגנים שורש7,9. בנוסף, תרבויות שונות השינוי השורש השתמשו בהרחבה כמערכת ניסיונית כדי לחקור את מסלולים ביוכימיים ואיתות כימי לייצר צמח משני מטבוליטים המשמשים כתרופות, קוסמטיקה, תוספי מזון8,10. מטבוליטים משניים יקרי ערך, כולל “אינדול אלקלואידים”, “הטרואידים”, “טרפננואידים”, ופלונונואידים, מסונתז בשורשים שעירים פראי-סוג, נחקרו במשך מספר עשורים במינים רבים, כגון ginsenoside ג’ינסנג11, coumarine ב ammi majus12, תרכובות פנופילית בשחפת2,13.
שורשים שעירים הופקו באמצעות . ריזוזוגנים ב 79 מינים צמחים מ 27 משפחות14. למשל, א. ריזוזוגנים-תיווך השינוי שורש שעירדווחה ב סויה15,16, מרווה17, plumbago indica18, לוטוס יפני19, ו עולש (cichorium intybus L) 20. TB שיער השינוי שורש יש גם נחקר2. פרוטוקולים מפורטים מעטים זמינים לגבי פיתוח של שורשים שעירים תיווך על ידי . ריזוגנים שנושאים וקטור בינארי או לא. למשל, סנדרה ואח ‘21 הציג שיטה של הפקת תפוחי אדמה שעירים שעיר מתמשכת בעלי סוג פראי נצרי. שורשים שעירים מפותח לחלוטין יכול להיות דמיינו 5-6 שבועות לאחר ההזרקה של . ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי גאס לתוך בלוטות הגזע של צמחי תפוחי אדמה. מחקר נוסף דיווח גם על מערכת שורש טרנסגניים השעיר הנגרמת על ידי . ריזוזוגנים מחסה את הגן העיתונאי gusa ב יוטה (מקהלה capsularis L.) 22. יתר על כן, Supaart ואח ‘23 השיגו שורשי טבק השעירים באמצעות . ריזוזוגנס שינתה את הביטוי וקטור pBI121 נושאת את הגן של Δ1-הטטרקאנאיפילית חומצה (thca) סטנדרטים לייצר thca.
עם זאת, תהליך צעד אחר צעד עבור הדור האפקטיבי של שינוי שורש בסיס, במיוחד בשחפת, הוכח פחות יחסית. במחקר זה, תיארנו פרוטוקול מפורט באמצעות. ריזוזוגנים נושאת את הגן העיתונאי (gfp), סמן סלקטיבי (Kan), וגנים של עניין (b4, מזוהה מהקבוצה שלנו אבל לא פורסם הגן מתוך סליל בסיסי לולאה-סליל (bhlh) משפחה) כדי ליצור שעיר השינוי הגנטי השורש בשחפת. הניסוי נמשך 5-6 שבועות, מן החיסונים של זרעים לדור שורשים שעירים, מעורבים הכנה ההסבר, זיהום, coculturing, subculturing, והתפשטות הבאים. יתר על כן, ריזוגנים המכילים בינארי פלבאמצע נושאת את שחפת מגנטית של שעתוק מיאלואובלסטוזיס גורם 116 (FtMYB116) שימש כדי לקבוע אם FtMYB116 יכול לקדם הצטברות של פלונונואידים, במיוחד rutin, בשחפת על הגן ואת רמת מטבולית באמצעות שחפת שיער שעירים שורש. FtMYB116, שהוא גורם המושרה באור, מווסת את סינתזה של רוטין בתנאי אור שונים5. כלקון סינתז (CHS), flavanone-3-הידרוקסילאז (F3H), פלונואיד-3′-הידרוקסילז (F3‘H), ופלונול סינתז (fls)24 הם אנזימים מפתח המעורבים במסלול חילוף החומרים של הביוטין של רוטין. לכן, מחקר זה מדגים את ביטוי היתר של FtMYB116 ב שורשים שעירים TB ואת הביטוי של גנים אנזים מפתח, כמו גם את התוכן של רוטין ופלבנואידים אחרים כגון quercetin.
Protocol
Representative Results
Discussion
TB נעשה שימוש בכמה מחקרים הקשורים מטבוליטים משני ברמות גנטיות ומטבולית1,2,5,27,28. תרבות שורש שעירים, כמקור ייחודי עבור ייצור מטבוליזם, ממלא תפקיד מרכזי בהנדסה מטבולית29 והוא יכול לשמש כדי לשנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו תמכה בקרנות המחקר הבסיסיות של מכוני מחקר בתחום הרווחה המרכזית ZXKT17002.
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
