تحريض جذور شعر من قبل Agrobacterium rhizogenes-بوساطة التحول في الحنطة السوداء التارتية(Fagopyrum tataricum)
Summary
نحن نصف طريقة لتحفيز جذور شعر من قبل Agrobacterium rhizogenes-بوساطة التحول في الحنطة السوداء Tartary(Fagopyrum tataricum). ويمكن استخدام هذا للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي في الحنطة السوداء الطرطرية، أو اعتمادها لأي تحول وراثي، أو استخدامها للنباتات الطبية الأخرى بعد التحسين.
Abstract
الحنطة السوداء الطرتارية (السل)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] تمتلك مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية لأنه يحتوي على الأيض الثانوية وفيرة مثل الفلافونويدات، وخاصة روتين. وقد استخدمت الجذور الزراعية البكتريا تدريجيا في جميع أنحاء العالم للحث على جذور شعر في النباتات الطبية للتحقيق في وظائف الجينات وزيادة غلة الأيض الثانوية. في هذه الدراسة، وصفنا طريقة مفصلة لتوليد جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتفي السل. تم اختيار Cotyledons ومحور تحت تأثير الحمل في 7-10 أيام كنباتات خارجية ومصابة بـ A. rhizogenes تحمل ناقلًا ثنائيًا ، مما أدى إلى جذور شعر ية مُرعرة مُرقدة ظهرت بعد أسبوع واحد. تم تحديد التحول الجذر المشعر المتولد على أساس مورفولوجيا، واختيار المقاومة (kanamycin)، والتعبير الجيني المراسل (بروتين الفلورسنت الأخضر). في وقت لاحق، تم نشر الجذور المشعرة المتحولة ذاتيا على النحو المطلوب. وفي الوقت نفسه، تم تحويل عامل النسخ mymyB116، إلى الجينوم السل باستخدام جذور مشعرة بوساطة A. رهيزوجيناتللتحقق من دور FtMYB116 في توليف الفلافونويدات. وأظهرت النتائج أن التعبير عن الجينات ذات الصلة بالفلافونويد وغلة مركبات الفلافونويد (الروتين والكيرسيتين) كانت بشكل كبير (p < 0.01) التي روجت لها FtMYB116، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام جذور مشعرة بوساطة الرهيزوجيناتكأداة بديلة فعالة للتحقيق في الوظائف الجينية وإنتاج الأيض الثانوي. يمكن اعتماد البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة الموصوفة في هذه الدراسة لتوليد جذور شعر لأي تحول وراثي أو غيرها من النباتات الطبية بعد التعديل.
Introduction
الحنطة السوداء الطرتاري (السل)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) هو نوع من dicotyledon ينتمي إلى جنس Fagopyrum والأسرة Polygonaceae1. ويحظى السل، بوصفه نوعاً من الأغذية المتجانسة للطب الصيني، باهتمام كبير بسبب تكوينه الكيميائي المميز وأنشطته البيولوجية المتنوعة ضد الأمراض. السل غني في المقام الأول بالكربوهيدرات والبروتينات والفيتامينات والكاروتينات وكذلك في البوليفينول مثل الأحماض الفينولية والفلافونويدات1. وقد أظهرت مختلف الأنشطة البيولوجية والدوائية من الفلافونويدات، بما في ذلك مضادات الأكسدة، خافض للضغط2،والمضادة للالتهابات، فضلا عن خصائص مضادة للسرطان ومضادة للسكري،3.
Agrobacterium rhizogenes هي بكتيريا التربة التي تساهم في تطوير مرض الجذر شعر في العديد من النباتات أعلى، وخاصة dicotyledons، عن طريق إصابة مواقع الجرح4،,5. هذه العملية بدأت من خلال نقل T-DNA في الجذر تحريض (Ri) plasmid5،6 وعادة ما يرافقه التكامل والتعبير عن الجينات الخارجية من البلازميد ري والخطوات اللاحقة لتوليد الورم الجذر شعر7. A. جذور رهيزوجيناتمجففة بوساطة، كأداة قوية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية، وقد استخدمت على نطاق واسع نظرا لإنتاجيتها مستقرة وعالية وسهولة الحصول عليها في فترة قصيرة. وعلاوة على ذلك، يتم تمييز الجذور شعر الناجمة عن A. رهيزوجينات بكفاءة من خلال تطوير جذر plagiotropic والنمو المتفرعة للغاية في متوسطة خالية من الهرمونات8. ويمكن استخدامها في عدة مجالات من البحوث، بما في ذلك إنتاج البذور الاصطناعية، وبحوث العقيدات الجذرية، وفي دراسة التفاعلات مع الكائنات الحية الأخرى مثل الفطريات mycorrhizal، والديدان الخيطية، ومسببات الأمراض الجذرية7،9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام ثقافات تحويل الجذر المشعرة على نطاق واسع كنظام تجريبي للتحقيق في المسارات الكيميائية الحيوية والإشارات الكيميائية وإنتاج الأيض الثانوية النباتية التي تستخدم كمستحضرات صيدلانية ومستحضرات تجميل وإضافات غذائية8،10. وقد تم التحقيق في الأيض الثانوية القيمة، بما في ذلك قلويدات الإندول، aconites، قلويدات التروبان، تيربينويدس، والفلافونويدات، توليفها في جذور شعر البرية من نوع لعدة عقود في العديد من الأنواع، مثل الجنسينوسيد في باناكس الجينسنغ11،الكوممارين في أمي ماجوس12،والمركبات الفينولية في السل2،,13.
وقد تم إنتاج جذور شعر باستخدام A. rhizogenes في 79 نوعا من النباتات من 27 أسرة14. على سبيل المثال، A. رهيزوجينات-بوساطةتحول الجذر شعر تم الإبلاغ في فول الصويا15،,16، سالفا17، Plumbago indica18،لوتس japonicus19،والهندباء(Cichorium intybus L.) 20. السل مشعر الجذر التحول كما تم التحقيق2. عدد قليل من البروتوكولات التفصيلية المتاحة بشأن تطوير جذور شعر بوساطة A. rhizogenes إما تحمل ناقل ثنائي أم لا. فعلى سبيل المثال، أدخلت ساندرا وآخرون21 طريقة لإنتاج جذور شعر بطاطا معدلة وراثياً مستدامة في براعم برية من النوع. يمكن تصور الجذور المشعرة المتطورة بالكامل بعد 5-6 أسابيع من حقن A. rhizogenes تحمل جين مراسل جوس في الإنترنودس الجذعية لنباتات البطاطا. كما أفادت دراسة أخرى نظام الجذر المشعر المعدلة وراثيا الناجمة عن A. rhizogenes إيواء جين مراسل gusA في الجوت(Corchorus capsularis L.) 22.وعلاوة على ذلك، حصل Supaart وآخرون23 على جذور مشعرة للتبغ المحورة وراثيا باستخدام A. rhizogenes تحولت مع التعبير ناقلات pBI121 تحمل جين منحمضرباعي هيدروكانابينوليك (THCA) synthase لإنتاج THCA.
ومع ذلك، فإن العملية التدريجية لتوليد فعال من التحول الجذري المشعر، وخاصة في مجال السل، كانت أقل وضوحاً نسبياً. في هذه الدراسة ، وصفنا بروتوكولًا مفصلًا باستخدام A. rhizogenes الذي يحمل جين المراسل(GFP)، وهو علامة انتقائية(Kan)، وجينًا مهمًا (b4) ، وهو جين محدد من مجموعتنا ولكنه غير منشور من حلزون حلقة أساسية(bHLH)الأسرة) لتوليد التحول الوراثي الجذر المشعر في السل. استمرت التجربة لمدة 5-6 أسابيع ، من تلقيح البذور إلى توليد الجذور المشعرة ، والتي تنطوي على إعداد النبزة ، والعدوى ، والتعبد ، والتبوّاب ، والانتشار اللاحق. وعلاوة على ذلك، تم استخدام A. rhizogenes التي تحتوي على البلازميد ثنائي يحمل transgene السل من عامل النسخ النخاعي 116(FtMYB116)لتحديد ما إذا كان FtMYB116 يمكن أن تعزز تراكم الفلافونويدات، وخاصة الروتين، في السل في الجين ومستوى التمثيل الغذائي من خلال التحول الجذر شعر السل. FtMYB116، وهو عامل النسخ الناجم عن الضوء ، وينظم توليف روتين تحت ظروف الإضاءة المختلفة5. Chalcone synthase(CHS)، فلافانون -3 – هيدروكسيلاز(F3H)، فلافونويد -3 ‘-هيدروكسيلاز(F3‘H)، والفلافونول synthase(FLS)24 هي الإنزيمات الرئيسية المشاركة في المسار الأيضي لعملية التركيب الحيوي روتين. لذلك ، توضح هذه الدراسة التعبير المفرط لـ FtMYB116 في جذور TB المشعرة والتعبير عن جينات الإنزيم الرئيسية وكذلك محتوى الروتين والفلافونويدات الأخرى مثل الكيرسيتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم السل في العديد من الدراسات المتعلقة بالأيض الثانوي على المستويات الوراثية والأيضية1،2،5،,27،28. ثقافة الجذر شعر، كمصدر فريد لإنتاج المستقلب، يلعب دورا محوريا في الهندسة الأيضية29</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل صناديق البحوث الأساسية لمعاهد بحوث الرعاية العامة المركزية ZXKT17002.
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
