アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)
Summary
我々は、アグロバクテリウム・リゾゲネスによって毛深い根を誘導する方法を記述する – 酒盤の媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)これは、タータリーそばにおける遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するために使用され、任意の遺伝的形質転換に採用されるか、または改善後の他の薬用植物に使用することができる。
Abstract
酒類そば(TB)[ファゴピルラムタタサリカム(L.)ゲールトン]は、フラボノイド、特にルチンなどの二次代謝産物が豊富に含まれているため、様々な生物学的および薬理学的活性を有する。アグロバクテリウム・リゾゲネスは、徐々に遺伝子機能を調査し、二次代謝産物の収量を増加させるために薬用植物の毛深い根を誘導するために、世界的に使用されてきました。本研究では、結核におけるA.根茎遺伝子媒介性毛状根を生成する詳細な方法を説明した。7~10日のコチルドンと低コチルド軸を外植体として選び、バイナリベクターを持つA.根茎に感染し、1週間後に出現した出現性の毛状根を誘発した。生成された毛深い根形質転換は、形態、抵抗性選択(カナマイシン)、レポーター遺伝子発現(緑色蛍光タンパク質)に基づいて同定した。その後、変換された毛深い根は、必要に応じて自己増殖した。一方、骨髄芽細胞症(MYB)転写因子FtMYB116は、フラボノイドの合成におけるFtMYB116の役割を検証するために、A.根茎遺伝子媒介毛根を用いて結核ゲノムに変換された。その結果、フラボノイド関連遺伝子の発現とフラボノイド化合物(ルチンおよびケルセチン)の収量がFtMYB116によって有意に促進された(p<0.01)ことを示し、A.根茎介在毛根が遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するための効果的な代替ツールとして使用できることを示した。毛深い根を生成するためのこの研究で説明されている詳細なステップバイステッププロトコルは、調整後に任意の遺伝的形質転換または他の薬用植物に採用することができる。
Introduction
酒類そば(TB)(ファゴピルム・タタリカム(L.)ゲールトン)は、ファゴピルム属及びファミリー・ポリゴンア科1に属するジコチルドンの一種である。中国医学の相同食品の一種として、結核は、その独特の化学組成と疾患に対する多様な生物活動のためにかなりの関心を受けています。TBは主に炭水化物、タンパク質、ビタミン、カロテノイド、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール類に富んでいます1.抗酸化、抗高血圧2、および抗炎症ならびに抗癌および抗糖尿病特性を含むフラボノイドの様々な生物学的および薬理活性が実証されている3。
アグロバクテリウム・リゾゲネスは、創傷部位44,55に感染することにより、いくつかの高等植物、特にジコチルドンにおける毛深い根疾患の発症に寄与する土壌細菌である。このプロセスは、根誘起(Ri)プラスミド55、66におけるT-DNAの転写によって開始され、一般的には、Riプラスミドからの外因性遺伝子の統合および発現と毛深い根表現型7を生成するステップを伴う。A. 根茎遺伝子-媒介トランスジェニック毛根は、植物バイオテクノロジーの分野における強力なツールとして、短期間での安定した高い生産性と容易な入手のために最も広く使用されてきた。さらに、A.根茎遺伝子によって誘導される毛深い根は、その形成的な根の発達とホルモンフリー培地8における高度に分岐する成長によって効率的に区別される。それらは、人工種子生産、根結節研究、および菌根菌菌、線虫、および根病原体77、99などの他の生物との相互作用を研究する研究を含むいくつかの研究分野で使用することができる。また、毛深い根形転換培養は、生化学的経路や化学シグナル伝達を調査し、医薬品、化粧品、食品添加物88,1010として使用される植物二次代謝産物を製造するための実験システムとして広く使用されている。野生型の毛状根で合成されたインドールアルカロイド、アコナイト、トロパネアルカロイド、フラボノイドなどの貴重な二次代謝産物は、数十年にわたり、パナックス人参11のギンセノシド、アムミマジャス12、およびフェノリック化合物で数十年にわたって調査2,されてきた。
毛深い根は、27家族から79種の植物種でA.根茎遺伝子を用いて製造されている14.例えば、A.根茎-媒介毛根形変換は、大豆15、16、サルビア17、プラムバゴインディカ18、ロータスジャポニクス19、チコリ(チコリウムインティバスL.)で報告されています。,1620.TB毛深い根形変換も調査済み 2.バイナリベクターを運ぶかどうかにかかわらず、A.根遺伝子によって媒介される毛深い根の発達に関して利用可能な詳細なプロトコルはほとんどありません。例えば、Sandra et al.21は野生型の芽に持続するトランスジェニックポテト毛状根を作製する方法を導入した。完全に発達した毛深い根は、ジャガイモ植物の茎間節にガスレポーター遺伝子を運ぶA.根茎遺伝子の注入後5〜6週間後に視覚化することができた。別の研究はまた、ジュートでgusAレポーター遺伝子を収容するA.根茎遺伝子によって誘発されるトランスジェニック毛状根系を報告していた(コーコーラスカプクラリスL.22さらに、Supaartら23は、Δ1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素の遺伝子を担持する発現ベクター pBI121で形質転換したA.根生遺伝子を用いてトランスジェニックタバコ毛状根を得てTHCAを産生する。
しかし、特に結核において、毛深い根形変換の効果的な生成のためのステップバイステップのプロセスは比較的実証されていない。本研究では、レポーター遺伝子(GFP)、選択的マーカー(Kan)、および対象遺伝子(b4)を用いた詳細なプロトコル(我々の群から同定されたが、基本的ならせんループらせん(bHLH)ファミリー)を用いて、結核における毛深い根遺伝子変換を生成する詳細なプロトコルについて説明した。実験は、外植の準備、感染、コキュレーション、培養、その後の伝播を含む、種子の接種から毛深い根の生成まで、5〜6週間続いた。さらに、骨髄芽細胞症転写因子116の結核トランスジーンを運ぶバイナリプラスミドを含むA.リゾゲレンスは、FtMYB116がTB毛根形変換を介して遺伝子および代謝レベルにおけるフラボノイド、特にルチンの蓄積を促進できるかどうかを決定するために使用された。FtMYB116は、光誘発転写因子であり、異なる光条件5の下でルチンの合成を調節する。カルボンシンターゼ(CHS)、フラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H)、フラボノイド-3’ヒドロキシラーゼ(F3’H)およびフラボノールシンターゼ(FLS)24は、ルチン生合成の代謝経路に関与する主要な酵素である。H24そこで、この研究は、結核性毛深い根におけるFtMYB116の過剰発現と主要な酵素遺伝子の発現、ならびにルチンおよびケルセチンなどの他のフラボノイドの含有量を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
結核は、遺伝的および代謝レベル,,1、2、5、27、282,5で二1次代謝産物に関連するいくつかの研究で使用されている。2728毛深い根培養は、代謝産物産生のユニークな供給源として、代謝工学29において極めて重要な役割を果たし、関連遺伝子を挿入するこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は中央公共福祉研究機関ZXKT17002の基礎研究基金によって支援されました。
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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