Inducción de raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformación mediada en trigo sarracenotataricum tataricum)

Tartary sarraceno (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) es un tipo de dicotiledón perteneciente al género Fagopyrum y la familia Polygonaceae¹. Como un tipo de alimento homóloga de la medicina china, la tuberculosis ha estado recibiendo un interés considerable debido a su composición química distintiva y diversas bioactividades contra las enfermedades. La tuberculosis es principalmente rica en carbohidratos, proteínas, vitaminas y carotenoides, así como en polifenoles como ácidos fenólicos y flavonoides^1. Varias actividades biológicas y farmacológicas de flavonoides, incluyendo antioxidante, antihipertensivo², y antiinflamatorias, así como propiedades anticancerígenas y antidiabéticas, se han demostrado³.

Agrobacterium rhizogenes es una bacteria del suelo que contribuye al desarrollo de la enfermedad de las raíces peludas en varias plantas superiores, especialmente dicotiledos, infectando los sitios de la herida^4,,5. Este proceso se inicia mediante la transferencia del ADN-T en el plásmido de inducción de raíces (Ri)^5,6 y se acompaña comúnmente de la integración y expresión de un gen exógeno del plásmido Ri y los pasos subsiguientes de generación del fenotipo de raíz peluda^7. A. rhizogenes-raíces vellosas transgénicas mediadas, como una poderosa herramienta en el campo de la biotecnología vegetal, han sido más ampliamente utilizados debido a su estable y alta productividad y fácil obtención en un corto período de tiempo. Por otra parte, raíces peludas inducidas por A. rizogenes se distinguen eficientemente por su desarrollo de raíz plagiotrópica y crecimiento altamente ramificado en un medio libre de hormonas⁸. Se pueden utilizar en varios campos de investigación, incluyendo la producción artificial de semillas, investigación de nódulos de raíz, y en el estudio de las interacciones con otros organismos como hongos micorrizas, nematodos, y patógenos de la raíz^7,9. Además, los cultivos de transformación de raíces peludas se han utilizado ampliamente como un sistema experimental para investigar las vías bioquímicas y la señalización química y para producir metabolitos secundarios vegetales que se utilizan como productos farmacéuticos, cosméticos y aditivos alimentarios^8,,10. Los valiosos metabolitos secundarios, incluyendo alcaloides indólicos, aconitas, alcaloides tropano, terpenoides y flavonoides, sintetizados en raíces peludas de tipo salvaje se han investigado durante varias décadas en numerosas especies, como el ginsenoside en Panax ginseng^11,coumarine en Ammi majus^12,y compuestos fenólicos en TB^2,,13.

Raíces peludas se han producido utilizando A. rizogenes en 79 especies de plantas de 27 familias¹⁴. Por ejemplo, A. rhizogenes-transformación de raíz peluda mediada se ha divulgado en soja^15,16, Salvia¹⁷, Plumbago indica¹⁸, Lotus japonicus¹⁹, y achicoria (Cichorium intybus L.) ²⁰. Tb transformación de raíz peluda también se ha investigado². Pocos protocolos detallados están disponibles con respecto al desarrollo de raíces peludas mediadas por A. rhizogenes ya sea que lleven un vector binario o no. Por ejemplo, Sandra et al.²¹ introdujeron un método para producir raíces peludas de papa transgénicas sostenidas en brotes de tipo salvaje. Las raíces peludas completamente desarrolladas podrían visualizarse 5-6 semanas después de la inyección de A. rizogenes llevando el gen del reportero de gus en los internodos del tallo de las plantas de papa. Otro estudio también había reportado un sistema radicular peludo transgénico inducido por A. rhizogenes albergando el gen reportero gusA en yute (Corchorus capsularis L.) ²².²³ obtuvieron raíces peludas de tabaco transgénica utilizando A. rhizogenes transformados con la expresión vector pBI121 que transporta el gen del ácido¹tetrahidrocannabinólico (THCA) para producir THCA.

Sin embargo, un proceso paso a paso para una generación efectiva de transformación de la raíz peluda, especialmente en la tuberculosis, ha sido relativamente menos demostrado. En este estudio, hemos descrito un protocolo detallado utilizando A. rhizogenes que llevan el gen reportero (GFP), un marcador selectivo (Kan), y un gen de interés (b4, un gen identificado de nuestro grupo pero inédito de la familia básica helix-loop-helix(bHLH)) para generar transformación genética de raíz peluda en TB. El experimento duró 5-6 semanas, desde la inoculación de semillas hasta la generación de raíces peludas, que involucraron la preparación de explantas, infección, cocultura, subcultura ción y posterior propagación. Además, A. rhizogenes que contiene un plásmido binario que transporta el transgén de tuberculosis del factor de transcripción de mieloblastosis 116 (FtMYB116) se utilizó para determinar si FtMYB116 puede promover la acumulación de flavonoides, particularmente la rutina, en la tuberculosis a nivel genético y metabólico a través de la transformación de la raíz peluda de TB. FtMYB116, que es un factor transcripcional inducido por la luz, regula la síntesis de rutina en diferentes condiciones de luz⁵. La calcocona sintasa (CHS), la flavanona-3-hidroxilasa (F3H), el flavonoide-3′-hidroxilasa (F3‘H) y la flavonol sintasa (FLS)²⁴ son enzimas clave implicadas en la vía metabólica de la biosíntesis de rutina. Por lo tanto, este estudio demuestra la sobreexpresión de FtMYB116 en raíces peludas de tuberculosis y la expresión de genes clave de enzimas, así como el contenido de rutina y otros flavonoides como la quercetina.