Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum)

Tartary boekweit (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) is een soort dicotyledon behorend tot het geslacht Fagopyrum en de familie Polygonaceae¹. Als een soort van Chinese geneeskunde homologe voedsel, tbc heeft aanzienlijke belangstelling ontvangen als gevolg van de onderscheidende chemische samenstelling en diverse bio-activiteiten tegen ziekten. Tbc is voornamelijk rijk aan koolhydraten, eiwitten, vitaminen en carotenoïden, evenals in polyfenolen zoals fenolzuren en flavonoïden¹. Verschillende biologische en farmacologische activiteiten van flavonoïden, waaronder antioxidatieve, antihypertensieve², en ontstekingsremmende evenals antikanker en antidiabetische eigenschappen, zijn aangetoond³.

Agrobacterium rhizogenes is een bodembacterie die bijdraagt aan de ontwikkeling van harige wortelziekte in verschillende hogere planten, vooral dicotyledons, door het infecteren van wondplaatsen^4,5. Dit proces wordt geïnitieerd door de overdracht van het T-DNA in het wortelopwekkende (Ri) plasmid^5,6 en gaat vaak gepaard met de integratie en expressie van een exogen eergen uit de Ri plasmid en de daaropvolgende stappen van het genereren van het harige wortelfenotype⁷. A. rhizogenes-gemedieerde transgene harige wortels, als krachtig instrument op het gebied van plantaardige biotechnologie, zijn het meest gebruikt vanwege hun stabiele en hoge productiviteit en gemakkelijke verkregen in een korte periode. Bovendien onderscheiden harige wortels veroorzaakt door A. rhizogenes zich efficiënt door hun plagiotropische wortelontwikkeling en een sterk vertakkende groei in een hormoonvrij medium⁸. Ze kunnen worden gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waaronder kunstmatige zaadproductie, wortelknobbelonderzoek, en bij het bestuderen van de interacties met andere organismen zoals mycorrhizal schimmels, aaltjes en wortelpathogenen^7,9. Bovendien zijn harige worteltransformatieculturen op grote schaal gebruikt als experimenteel systeem om de biochemische trajecten en chemische signalering te onderzoeken en om secundaire metabolieten van planten te produceren die worden gebruikt als farmaceutische producten, cosmetica en levensmiddelenadditieven^8,10. De waardevolle secundaire metabolieten, waaronder indole alkaloïden, aconites, tropane alkaloïden, terpenoïden en flavonoïden, gesynthetiseerd in wilde harige wortels zijn onderzocht voor meerdere decennia in tal van soorten, zoals ginsenoside in Panax ginseng¹¹, coumarine in Ammi majus¹², en fenolverbindingen in TB^2,13.

Harige wortels zijn geproduceerd met behulp van A. rhizogenes in 79 plantensoorten uit 27 families¹⁴. Bijvoorbeeld, A. rhizogenes-gemedieerde harige wortel transformatie is gemeld in sojabonen^15,16, Salvia¹⁷, Plumbago indica¹⁸, Lotus japonicus¹⁹, en witloof(Cichorium intybus L.) ²⁰. TB harige wortel transformatie is ook onderzocht². Weinig gedetailleerde protocollen zijn beschikbaar met betrekking tot de ontwikkeling van harige wortels bemiddeld door A. rhizogenes ofwel het dragen van een binaire vector of niet. Zo introduceerden Sandra et al.²¹ een methode voor de productie van transgene aardappelharige wortels die in wilde scheuten worden ondersteund. De volledig ontwikkelde harige wortels kunnen 5-6 weken na de injectie van A. rhizogenes worden gevisualiseerd die het gus reporter gen in de stengelinternodes van aardappelplanten vervoeren. Een andere studie had ook gemeld een transgene harige wortelstelsel geïnduceerd door A. rhizogenes herbergen de gusA reporter gen in jute(Corchorus capsularis L.) ²². Bovendien verkregen Supaart et al.²³ transgene tabaksharige wortels met behulp van A. rhizogenes getransformeerd met de expressievector pBI121 die het gen van Δ¹-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase draagt om THCA te produceren.

Echter, een stap-voor-stap proces voor een effectieve generatie van harige wortel transformatie, vooral in TB, is relatief minder aangetoond. In deze studie hebben we beschreven een gedetailleerd protocol met behulp van A. rhizogenes die de reporter gen (GFP), een selectieve marker (Kan), en een gen van belang (b4, een geïdentificeerd uit onze groep, maar ongepubliceerd gen uit fundamentele helix-loop-helix(bHLH) familie) om harige wortel genetische transformatie in TTb te genereren. Het experiment duurde 5-6 weken, van de inenting van zaden tot het genereren van harige wortels, waarbij de explant voorbereiding, infectie, coculturing, subculturing, en de daaropvolgende voortplanting. Bovendien werd A. rhizogenes die een binaire plasmid bevat die het tbc-transgene van myeloblastosetranscriptiefactor 116(FtMYB116)draagt, gebruikt om te bepalen of FtMYB116 de accumulatie van flavonoïden, met name rutine, in tbc kan bevorderen op gen- en metabolisch niveau door de tbc-harige worteltransformatie. FtMYB116, dat is een licht-geïnduceerde transcriptie factor, regelt de synthese van rutin ei onder verschillende lichtomstandigheden⁵. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoïde-3′-hydroxylase (F3‘H), en flavonol synthase (FLS)²⁴ zijn belangrijke enzymen die betrokken zijn bij de metabole route van rutine biosynthese. Daarom toont deze studie de overexpressie van FtMYB116 bij tbc harige wortels en de expressie van belangrijke enzymgenen, evenals de inhoud van rutine en andere flavonoïden zoals quercetine.