Agrobacterium rhizogenestarafından Kıllı Kökleri Indükleyen -Tartary Karabuğday Aracılı Dönüşüm (Fagopyrum tataricum)
Summary
Biz Agrobacterium rhizogenestarafından kıllı kökleri indükleyen bir yöntem tarif -Tartary karabuğday aracılı dönüşüm (Fagopyrum tataricum). Bu gen fonksiyonları ve Tartary karabuğday ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için kullanılabilir, herhangi bir genetik dönüşüm için kabul edilebilir, ya da iyileştirme den sonra diğer tıbbi bitkiler için kullanılır.
Abstract
Tartary karabuğday (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] flavonoidler gibi bol ikincil metabolitleri içerdiğinden çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetlere sahip, özellikle rutin. Agrobacterium rhizogenes yavaş yavaş gen fonksiyonlarını araştırmak ve ikincil metabolitlerin verimini artırmak için tıbbi bitkilerde kıllı kökleri ikna etmek için dünya çapında kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Tüberkülozda A. rhizogenesaracılı kıllı kökler oluşturmak için ayrıntılı bir yöntem tanımlanmıştır. 7-10 günde cotyledons ve hipokotendoner eksen eksektive 1 hafta sonra ortaya çıkan adventif tüylü kökleri indükleyen ikili vektör taşıyan A. rhizogenes ile enfekte edildi. Oluşturulan kıllı kök dönüşümü morfolojisi, direnç seçimi (kanamisin) ve muhabir gen ekspresyonu (yeşil floresan protein) temelinde tanımlanmıştı. Daha sonra, dönüştürülmüş kıllı kökleri gerektiği gibi kendini yayılım edildi. Bu arada, bir myeloblastoz (MYB) transkripsiyon faktörü, FtMYB116, A. rhizogeneskullanarak TB genomuna dönüştürüldü -flavonoidlerin sentezinde FtMYB116 rolünü doğrulamak için aracılı tüylü kökler. Sonuçlar flavonoid ile ilgili genlerin ekspresyonu ve flavonoid bileşiklerin verimi (rutin ve quercetin) önemli ölçüde (p < 0.01) FtMYB116tarafından teşvik olduğunu gösterdi , A. rhizogenes-aracılıtüylü kökleri gen fonksiyonları ve ikincil metabolitlerin üretimini araştırmak için etkili bir alternatif araç olarak kullanılabilir gösteren. Bu çalışmada kıllı kökler üretmek için açıklanan ayrıntılı adım adım protokol, ayarlamadan sonra herhangi bir genetik dönüşüm veya diğer tıbbi bitkiler için kabul edilebilir.
Introduction
Tartary karabuğday (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) Fagopyrum ve familya polygonaceae1familyasına ait bir dicotyledon türüdür. Çin tıbbı homolog gıda bir tür olarak, Tüberküloz kendine özgü kimyasal bileşimi ve hastalıklara karşı çeşitli biyofaaliyetleri nedeniyle önemli ilgi almaktadır. Tüberküloz öncelikle karbonhidratlar, proteinler, vitaminler ve karotenoidler yanı sıra fenolik asitler ve flavonoidler 11gibi polifenoller açısından zengindir. Antioksidatif, antihipertansif2ve anti-inflamatuar yanı sıra antikanser ve antidiyabetik özellikleri de dahil olmak üzere flavonoidlerin çeşitli biyolojik ve farmakolojik faaliyetleri,gösterilmiştir 3.
Agrobacterium rhizogenes yara siteleri 4 enfekte tarafından birkaç yüksek bitkilerde kıllı kök hastalığı gelişimine katkıda bulunan bir toprak bakterisidir, özellikle dicotyledons,.,5 Bu süreç kök indükleyici T-DNA transferi ile başlatılan (Ri) plazmid5,6 ve genellikle entegrasyonu ve Ri plazmid bir eksojen genin ekspresyonu ve tüylü kök fenotip üreten sonraki adımları eşlik eder7. A. rhizogenes-aracılıtransgenik tüylü kökleri, bitki biyoteknolojisi alanında güçlü bir araç olarak, en yaygın olarak istikrarlı ve yüksek verimlilik ve kısa bir süre içinde kolay elde edilmesi nedeniyle kullanılmaktadır. Ayrıca, A. rhizogenes tarafından indüklenen kıllı kökleri verimli bir hormonsuz orta8onların plagiotropic kök gelişimi ve yüksek dallanma büyüme ile ayırt edilir. Yapay tohum üretimi, kök nodül araştırmaları ve mikorbozial mantarlar, nematodlar ve kök patojenleri gibi diğer organizmalarla etkileşimleri inceleyerek7,9. Buna ek olarak, tüylü kök dönüşüm kültürleri yaygın biyokimyasal yollar ve kimyasal sinyalaraştırmak ve ilaç, kozmetik ve gıda katkı maddeleri8,,10olarak kullanılan bitki ikincil metabolitleri üretmek için deneysel bir sistem olarak kullanılmıştır. Indole alkaloidler, aconites, tropane alkaloidler, terpenoidler ve flavonoidler de dahil olmak üzere değerli ikincil metabolitleri, yabani tip tüylü kökleri sentezlenen çok sayıda tür için birkaç on yıl için araştırılmıştır, Panax ginseng ginsensidegibi11, Ammi majuscoumarine12, ve TB fenolik bileşikler2,13.
Tüylü kökler 27 aileden 79 bitki türünde A. rhizogenes kullanılarak üretilmiştir14. Örneğin, A. rhizogenes-aracılı kıllı kök dönüşümü soya fasulyesi bildirilmiştir15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, ve hindiba(Cichorium intybus L.) 20. Tüberküloz kıllı kök dönüşümü de araştırılmıştır2. Birkaç ayrıntılı protokoller A. rhizogenes ya bir ikili vektör taşıyan ya da taşıma aracılık kıllı köklerin gelişimi ile ilgili mevcuttur. Örneğin, Sandra ve ark.21 yabani tip sürgünler sürdürülen transgenik patates kıllı kökleri üreten bir yöntem tanıttı. Tamamen gelişmiş kıllı kökler, gus muhabiri genini taşıyan A. rhizogenes’in enjekte edilmesinden 5-6 hafta sonra patates bitkilerinin kök internodlarına görselleştirilebilir. Başka bir çalışmada da jüt gusA muhabiri gen barındıran A. rhizogenes tarafından indüklenen bir transgenik kıllı kök sistemi bildirilmiştir(Corchorus capsularis L.) 22– Ayrıca, Supaart ve ark.23 elde transgenik tütün tüylü kökleri A. rhizogenes ifade vektörü pBI121 δ1-tetrahidrokanabinolik asit (THCA) synthase gentaşıyan ile dönüştürülmüş thca üretmek için dönüştürülmüştür.
Ancak, özellikle Tüberküloz’da etkili bir kıllı kök dönüşümü nesli için adım adım bir süreç nispeten daha az gösterilmiştir. Bu çalışmada, TB’de kıllı kök genetik dönüşümü oluşturmak için muhabiri gen(GFP), seçici bir belirteç(Kan)ve bir ilgi geni(b4), grubumuzdan tanımlanan ancak temel sarlis-döngü-sarlis(bHLH)ailesinden yayınlanmamış gen) taşıyan A. rhizogenes kullanılarak ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Deney, tohumların aşılanmasından, eksplant hazırlama, enfeksiyon, koculturing, subculturing ve daha sonraki yayılmayı içeren kıllı köklerin oluşumuna kadar 5-6 hafta sürdü. Ayrıca, FtMYB116’nın tüberküloz kökü dönüşümü yoluyla tb ve metabolik düzeyde flavonoidlerin, özellikle rutin olarak, flavonoidlerin birikimini teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için myeloblastoz transgene116(FtMYB116)tb transgenesini taşıyan ikili plazmid içeren arhizogenler kullanıldı. FtMYB116, ışık kaynaklı transkripsiyonel bir faktördür, farklı ışık koşullarında rutin sentezini düzenler5. Chalcone synthase(CHS), flavanon-3-hidroksilaz (F3H), flavonoid-3′-hidroksilaz (F3‘H), ve flavonol synthase (FLS)24 rutin biyosentezin metabolik yolu ile ilgili anahtar enzimlerdir. Bu nedenle, bu çalışma FtMYB116’nın TB kıllı köklerinde aşırı ekspresyonu ve anahtar enzim genlerinin ekspresyonunu ve quercetin gibi rutin ve diğer flavonoidlerin içeriğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüberküloz genetik ve metabolik düzeylerde sekonder metabolitleri ile ilgili çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır1,2,5,27,,28. Kıllı kök kültürü, metabolit üretimi için benzersiz bir kaynak olarak, metabolik mühendislik önemli bir rol oynar29 ve ilgili genler ekleyerek metabolik yolları değiştirmek için kullanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Merkezi kamu refahı araştırma enstitüleri ZXKT17002 için Temel Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
