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Biochemistry

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

Abstract

Chemische und biokonjugationische Techniken wurden in den letzten Jahren schnell entwickelt und ermöglichen den Aufbau von Proteinpolymeren. Ein kontrollierter Proteinpolymerisationsprozess ist jedoch immer eine Herausforderung. Hier haben wir eine enzymatische Methodik entwickelt, um polymerisiertes Protein Schritt für Schritt in einer rational gesteuerten Sequenz zu konstruieren. Bei dieser Methode ist der C-Terminus eines Proteinmonomers NGL für die Proteinkonjugation mit OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), während der N-Terminus eine skleavable TEV (Tabak-Etch-Virus) Spaltungsstelle plus ein L (ENLYFQ/GL) zum vorübergehenden N-Terminal-Schutz war. Folglich konnte OaAEP1 jeweils nur ein Proteinmonomer hinzufügen, und dann spaltete die TEV-Protease die N-Terminus zwischen Q und G, um den NH2-Gly-Leu freizulegen. Dann ist das Gerät bereit für die nächste OaAEP1 Ligation. Das entwickelte Polyprotein wird durch Die Entfaltung einzelner Proteindomäne mittels atomarer Mikroskopie-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (AFM-SMFS) untersucht. Daher bietet diese Studie eine nützliche Strategie für Die Polyprotein-Engineering und Immobilisierung.

Introduction

Im Vergleich zu synthetischen Polymeren haben natürliche Mehrdomänenproteine eine einheitliche Struktur mit einer gut kontrollierten Anzahl und Art der Subdomains1. Diese Funktion führt in der Regel zu einer verbesserten biologischen Funktion und Stabilität2,3. Viele Ansätze, wie z. B. die Zysulfidbindungskopplung und die rekombinante DNA-Technologie, wurden für den Aufbau eines solchen polymerisierten Proteins mit mehreren Domänen4,5,6,7entwickelt. Die erste Methode führt jedoch immer zu einer zufälligen und unkontrollierten Sequenz, und die zweite führt zu anderen Problemen, einschließlich der Schwierigkeit für die Überexpression toxischer und großformatigen Proteine und der Reinigung komplexer Proteine mit Kofaktor und anderen empfindlichen Enzymen.

Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, entwickeln wir eine enzymatische Methode, die Proteinmonomer für Polymer/Polyprotein schrittweise mit einer Proteinligase OaAEP1 in Kombination mit einem Protease TEV8,9konjugiert. OaAEP1 ist eine strenge und effiziente Endopeptidase. Zwei Proteine können kovalent als Asn-Gly-Leu-Sequenz (NGL) durch zwei Termini von OaAEP1 in weniger als 30 min verbunden werden, wenn der N-Terminus Gly-Leu-Rückstände(GL) und das andere, von dem der C-Terminus NGL-Rückstände10ist. Die Verwendung von OaAEP1 führt jedoch nur zur Verknüpfung von Proteinmonomer zu einem Proteinpolymer mit einer unkontrollierten Sequenz wie der Cystein-basierten Kopplungsmethode. Daher entwerfen wir den N-Terminus der Proteineinheit mit einer abnehmbaren TEV-Protease-Site plus einem Leucin-Rückstand als ENLYFQ/G-L-POI. Vor der TEV-Spaltung würde das N-Terminal nicht an der OaAEP1-Liga teilnehmen. Und dann werden die GL-Rückstände am N-terminus, die mit weiterer OaAEP1-Ligatur kompatibel sind, nach der TEV-Spaltung freigelegt. So haben wir eine sequenzielle enzymatische Biosynthesemethode von Polyprotein mit einer relativ gut kontrollierten Sequenz erreicht.

Hier kann unsere schrittweise enzymatische Synthesemethode in der Polyproteinprobenvorbereitung eingesetzt werden, einschließlich sequenzgesteuerter und unkontrollierter, und Proteinimmobilisierung auch für Einzelmolekül-Studien, insbesondere für das komplexe System wie Metalloprotein.

Darüber hinaus ermöglichen uns AFM-basierte SMFS-Experimente, die Proteinpolymerkonstruktion und -stabilität auf Einzelmolekülebene zu bestätigen. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, einschließlich AFM, optischer Pinzette und magnetischer Pinzette, ist ein allgemeines Werkzeug in der Nanotechnologie, um Biomoleküle mechanisch zu manipulieren und deren Stabilität zu messen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein-Molekül AFM wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Protein (un)folding21,22,23,24,25, die Festigkeitsmessung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische Bindung20,36,37,38,39,40,41,42,43 und Metall-Ligand-Bindung in Metallprotein44,45,46,47,48,49,50 . Hier wird einmolekulares AFM verwendet, um die synthetisierte Polyproteinsequenz auf Basis des entsprechenden Proteinentfaltungssignals zu verifizieren.

Protocol

1. Proteinproduktion Genklon Kaufen Sie Gene, die für das Protein von Interesse (POI) kodieren: Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, das Cellulose-Bindungsmodul (CBM), dockerin-X Domain (XDoc) und Kohäsion aus Ruminococcus flavefacience, Tabak-Etch-Virus (TEV) Protease, Elastin-ähnliche Polypeptide (ELPs). Führen Sie polymerase-Kettenreaktion durch und verwenden Sie das Drei-Restriktions-Verdauungsenzymsystem BamHI-BglII-…

Representative Results

Die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht werden, haben keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, da die Entfaltungskraft (<Fu>) und das Konturlängeninkrement (<-Lc>) mit der vorherigen Studie vergleichbar ist (Abbildung 1). Das Reinigungsergebnis des Rubredoxin-Proteins ist in Abbildung 2dargestellt. Um das Protein nach der TEV-Spaltung zu beweisen, ist es kompatibel mi…

Discussion

Wir haben ein Protokoll zur enzymatischen Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein beschrieben und das Polyproteindesign durch AFM-basierte SMFS verifiziert. Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für den Aufbau des Protein-Polymers in einer entworfenen Sequenz, die frühere Methoden für Polyprotein-Engineering und Immobilisierung4,6,52,53,54<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. BK20160639) und Shuangchuang-Programm der Provinz Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
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