JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Biochemistry

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Abstract

Técnicas químicas e de bioconjugação foram desenvolvidas rapidamente nos últimos anos e permitem a construção de polímeros proteicos. No entanto, um processo controlado de polimerização proteica é sempre um desafio. Aqui, desenvolvemos uma metodologia enzimática para a construção de proteína polimerizada passo a passo em uma sequência racionalmente controlada. Neste método, o C-terminus de um monomer proteico é NGL para conjugação de proteínas usando o oaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) enquanto o N-terminus foi um site de decote tev (vírus etch de tabaco) cleavable mais um L (ENLYFQ/GL) para proteção temporária n-terminal. Consequentemente, o OaAEP1 foi capaz de adicionar apenas um monomer de proteína de cada vez, e então o TEV protease cedeu o N-terminus entre Q e G para expor o NH2-Gly-Leu. Em seguida, a unidade está pronta para a próxima ligadura OaAEP1. A poliproteína projetada é examinada por um uso do domínio proteico individual usando espectroscopia de força única baseada em microscopia atômica (AFM-SMFS). Portanto, este estudo fornece uma estratégia útil para a engenharia de poliproteínas e a imobilização.

Introduction

Em comparação com polímeros sintéticos, proteínas naturais multidomínios têm uma estrutura uniforme com um número bem controlado e tipo de subdomínios1. Esse recurso geralmente leva a uma melhor função biológica e estabilidade2,3. Muitas abordagens, como acoplamento de ligação de dimisina à base de cisínea e tecnologia de DNA recombinante, foram desenvolvidas para a construção de uma proteína polimerizada com múltiplos domínios4,5,6,7. No entanto, o método anterior sempre resulta em uma sequência aleatória e descontrolada, e o último leva a outros problemas, incluindo a dificuldade para a superexpressão de proteínas tóxicas e de grande porte e a purificação de proteínas complexas com cofator e outras enzimas delicadas.

Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos um método enzimático que conjuga monomer proteático em conjunto para polímero/poliproteína de forma stepwise usando uma proteína ligase OaAEP1 combinada com um TEV 8protease,9. OaAEP1 é uma endopeptidase rigorosa e eficiente. Duas proteínas podem ser ligadas covalentemente como sequência Asn-Gly-Leu (NGL) através de dois termini por OaAEP1 em menos de 30 min se o N-terminus for resíduos Gly-Leu (GL) e a outra do qual o terminal C é resíduos NGL10. No entanto, o uso do OaAEP1 apenas para ligar o monômero de proteína leva a um polímero proteico com uma sequência descontrolada como o método de acoplamento à base de cisteína. Portanto, projetamos o N-terminus da unidade proteica com um local protease TEV removível mais um resíduo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes do decote TEV, o n-terminal não participaria da ligadura OaAEP1. E então os resíduos GL no N-terminus, que são compatíveis com a ligadura OaAEP1, são expostos após o decote TEV. Assim, alcançamos um método sequencial de biosíntese enzimática de poliproteína com uma sequência relativamente bem controlada.

Aqui, nosso método de síntese enzimática stepwise pode ser usado na preparação de amostras de poliproteína, incluindo controlado por sequência e descontrolado, e imobilização proteica para estudos de moléculaúnica também, especialmente para o sistema complexo, como metaloproteína.

Além disso, os experimentos de SMFS baseados em AFM nos permitem confirmar a construção e estabilidade do polímero de proteína no nível de uma única molécula. A espectroscopia de força de molécula única, incluindo AFM, pinça óptica e pinça magnética, é uma ferramenta geral na nanotecnologia para manipular a biomolécula mecanicamente e medir sua estabilidade11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. A AFM de molécula única tem sido amplamente utilizada no estudo da proteína (un)dobrável21,22,23,24,25, a medida de força do receptor-ligand interação26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, ligação química inorgânica20,36,37,38,39,40,41,42,43e metal-ligand vínculo em metaloproteína44,45,46,47,48,49, 50 . Aqui, a AFM de uma única molécula é usada para verificar a sequência de poliproteína sintetizada com base no sinal de desdobramento da proteína correspondente.

Protocol

1. Produção de proteínas Clone genético Compre genes codificando para a proteína de interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxina (RD)51, o módulo de ligação de celulose (CBM), o domínio dockerin-X (XDoc) e coesão de Ruminococcus flavefacience,protease do vírus da gravação de tabaco (TEV), polipeptídeos semelhantes à elastina (ELPs). Realize a reação da cadeia de polimerase e use o sistema de enzimas de digestão de três restri…

Representative Results

Os resíduos ngl introduzidos entre proteínas adjacentes pela ligadura OaAEP1 não afetarão a estabilidade do monômero de proteína sonímero no polímero como a força desdobrada (<Fu>), e o incremento de comprimento de contorno (<ΔLc>) é comparável com o estudo anterior (Figura 1). O resultado purificatório da proteína rubredoxina é mostrado na Figura 2. Para provar a proteína após o decote TEV ser compatível com a seguinte li…

Discussion

Descrevemos um protocolo de biossíntese enzimática e imobilização da poliproteína e verificamos o projeto de poliproteína pela SMFS baseada em AFM. Essa metodologia fornece uma nova abordagem para a construção do polímero proteico em uma sequência projetada, que complementa métodos anteriores para engenharia de poliproteína e imobilização4,6,52,53,54</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant no. 21771103, 21977047), Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (Grant No. BK20160639) e Shuangchuang Program of Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. i. J., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O’Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Tags

OaAEP1Enzymatic SynthesisPolymerized ProteinSingle-molecule Force SpectroscopyProtein OligomerPolymerization DegreeProtein-based MaterialCysteinePotassium ChromateSulfuric AcidAPTESSulfo-SMCCGL-ELP-50 Cys-proteinCantilever Surface

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image