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Biochemistry

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Published: February 05, 2020
doi:
10.3791/60774
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour conjuguer le monomère de protéine par des enzymes formant le polymère de protéine avec une séquence commandée et l’immobiliser sur la surface pour des études de spectroscopie de force d’une molécule simple.

Abstract

Les techniques chimiques et de bioconjugation ont été développées rapidement ces dernières années et permettent la construction de polymères protéiques. Cependant, un processus de polymérisation des protéines contrôlée est toujours un défi. Ici, nous avons développé une méthodologie enzymatique pour construire des protéines polymérisées étape par étape dans une séquence rationnellement contrôlée. Dans cette méthode, le c-terminus d’un monomère de protéine est NGL pour la conjugaison de protéine utilisant OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) tandis que le N-terminus était un site de clivage cleavable de TEV (virus d’etch de tabac) plus un L (ENLYFQ/GL) pour la protection temporaire de N-terminal. Par conséquent, OaAEP1 a été en mesure d’ajouter un seul monomère de protéines à la fois, puis la protéase TEV clivé le N-terminus entre Q et G pour exposer le NH2-Gly-Leu. Ensuite, l’unité est prête pour la prochaine ligature OaAEP1. La polyprotéine modifiée est examinée en dépliant le domaine de protéine individuelle utilisant la spectroscopie de force unique à base de microscopie atomique (AFM-SMFS). Par conséquent, cette étude fournit une stratégie utile pour l’ingénierie et l’immobilisation des polyprotéines.

Introduction

Comparéaux aux polymères synthétiques, les protéines multi-domaines naturelles ont une structure uniforme avec un nombre et un type bien contrôlés de sous-domaines1. Cette caractéristique conduit généralement à l’amélioration de la fonction biologique et la stabilité2,3. Beaucoup d’approches, telles que le couplage disulfure à base de cystéine et la technologie recombinante d’ADN, ont été développées pour construire une telle protéine polymérisée avec les domaines multiples4,5,6,7. Cependant, la première méthode aboutit toujours à une séquence aléatoire et incontrôlée, et la seconde conduit à d’autres problèmes, y compris la difficulté pour la surexpression des protéines toxiques et de grande taille et la purification de protéines complexes avec cofactor et d’autres enzymes délicates.

Pour relever ce défi, nous développons une méthode enzymatique qui combine monomère de protéines ensemble pour polymère / polyprotéine d’une manière progressive en utilisant une ligase de protéines OaAEP1 combiné avec une protéase TEV8,9. OaAEP1 est un endopeptidase strict et efficace. Deux protéines peuvent être reliées de façon covalente comme séquence Asn-Gly-Leu (NGL) à travers deux termini par OaAEP1 en moins de 30 min si le terminus N est résidus Dely-Leu (GL) et l’autre dont le c-terminus est résidus NGL10. Cependant, l’utilisation d’OaAEP1 seulement pour lier le monomère de protéine mène à un polymère de protéine avec une séquence incontrôlée comme la méthode de couplage cystéine-basée. Par conséquent, nous concevons le N-terminus de l’unité protéique avec un site amovible de protéase TEV plus un résidu de leucine comme ENLYFQ/G-L-POI. Avant le clivage TEV, le N-terminal ne participerait pas à la ligature OaAEP1. Et puis les résidus de GL à N-terminus, qui sont compatibles avec d’autres ligature OaAEP1, est exposé après le clivage TEV. Ainsi, nous avons réalisé une méthode de biosynthèse enzymatique séquentielle de polyprotéine avec une séquence relativement bien contrôlée.

Ici, notre méthode de synthèse enzymatique progressive peut être utilisée dans la préparation d’échantillons de polyprotéines, y compris la séquence contrôlée et incontrôlée, et l’immobilisation des protéines pour les études monomolécules ainsi, en particulier pour le système complexe tel que métalloprotéine.

De plus, les expériences SMFS basées sur l’AFM nous permettent de confirmer la construction et la stabilité des polymères protéiques au niveau d’une seule molécule. La spectroscopie de force d’une seule molécule, y compris l’AFM, la pince optique et la pince magnétique, est un outil général en nanotechnologie pour manipuler mécaniquement la biomolécule et mesurer leur stabilité11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM monomolécule a été largement utilisé dans l’étude des protéines (non)pliage21,22,23,24,25, la mesure de la force de l’interaction récepteur-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, liaison chimique inorganique20,36,37,38,39,40,41,42,43 et métal-ligand bond en metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Ici, l’AFM monomolécule est utilisé pour vérifier la séquence de polyprotéine synthétisée basée sur le signal de progression de la protéine correspondante.

Protocol

1. Production de protéines Clone génétique Acheter des gènes codant pour la protéine d’intérêt (POI) : Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, le module de cellulose-contraignant (CBM), le domaine de dockerin-X (XDoc) et la cohésion de Ruminococcus flavefacience, le virus de l’etch de tabac (TEV), les polypeptides d’élastine-like (ELPs). Effectuer la réaction en chaîne de polymérase et utiliser le système d’enzymes de digestion à trois …

Representative Results

Les résidus de NGL introduits entre les protéines adjacentes par la ligature OaAEP1 n’affecteront pas la stabilité du monomère protéique dans le polymère, car la force qui se déroule (lt;Fuet l’augmentation de la longueur du contour (lt;Lc’estcomparable à l’étude précédente (Figure 1). Le résultat de purification de la protéine rubredoxine est montré dans la figure 2. Pour prouver la protéine après clivage TEV est compatible…

Discussion

Nous avons décrit un protocole pour la biosynthèse enzymatique et l’immobilisation de la polyprotéine et vérifié la conception de polyprotéine par SMFS AFM-basé. Cette méthodologie fournit une nouvelle approche à la construction de la protéine-polymère dans une séquence conçue, qui complète les méthodes précédentes pour l’ingénierie et l’immobilisation des polyprotéines4,6,52,53</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) et Shuangchuang De la province du Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).
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