OaAEP1-опосредованный ферментативный синтез и иммобилизация полимеризованного белка для одномолекулярной силовой спектроскопии

По сравнению с синтетическими полимерами, натуральные мультидоменные белки имеют единую структуру с хорошо контролируемым числом и типом субдоменов^1. Эта функция обычно приводит к улучшению биологической функции и стабильности^2,3. Многие подходы, такие как цистеин основе дисульфидных связей и рекомбинантных технологий ДНК, были разработаны для создания такого полимерного белка с несколькими доменами^4,5,6,7. Однако первый метод всегда приводит к случайной и неконтролируемой последовательности, а второй приводит к другим проблемам, в том числе к трудностям для переэкспрессии токсичных и крупногабаритных белков и очищения сложного белка с кофактором и другими деликатными ферментами.

Чтобы решить эту задачу, мы разрабатываем ферментационный метод, который совмещает белок мономер вместе для полимера / полипротеина в шаг ею с помощью белка лигазы OaAEP1 в сочетании с протеаза TEV^8,9. OaAEP1 является строгим и эффективным эндопептидаза. Два белка могут быть связаны ковалентно, как Asn-Gly-Leu последовательности (NGL) через два termini OaAEP1 менее чем за 30 минут, если N-терминов является Гли-Леу остатков (GL) и другой из которых C-терминус NGL остатков¹⁰. Однако, использование OaAEP1 только для того чтобы связать мономер протеина водит к полимеру протеина с uncontrolled последовательностью как метод соединения на основе cysteine. Таким образом, мы проектируем N-терминус белкового блока со съемным участком протеазы TEV плюс остатки лейцина в виде ENLYF/G-L-POI. До расщепления TEV, N-терминал не будет участвовать в перевязке OaAEP1. И тогда остатки GL на N-терминус, которые совместимы с дальнейшей перевязкой OaAEP1, подвергается после расщепления TEV. Таким образом, мы достигли последовательного ферментативного метода биосинтеза полипротеина с относительно хорошо контролируемой последовательностью.

Здесь наш метод поэтапного ферментативного синтеза может быть использован в подготовке полипротеиновых образцов, включая контролируемую последовательность и неконтролируемую, и протеиновой иммобилизации для одномолекулярных исследований, особенно для сложной системы, такой как металлопротеин.

Кроме того, эксперименты SMFS на основе AFM позволяют нам подтвердить конструкцию полимера и стабильность белка на одномолекулярном уровне. Одномолекулярная силовая спектроскопия, включая AFM, оптический пинцет и магнитный пинцет, является общим инструментом в нанотехнологии для механически управления биомолекулой и измерения их стабильности^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. Одномолекулярный AFM широко используется в изучении белка(un), складывая^21,22,23,25,измерения прочности взаимодействия рецептор-лиганд^{26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35}, неорганические химические связи^{20,36,37,38,39,40,41,42,43} и металло-лиганд связи в металлопротеина^{44,45,46,47,48,49,50} . Здесь одномолекулярный AFM используется для проверки синтезированной последовательность полипротеинов на основе соответствующего белка разворачивается сигнала.