Summary

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Published: February 05, 2020
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Abstract

Las técnicas químicas y de bioconjugación se han desarrollado rápidamente en los últimos años y permiten la construcción de polímeros proteicos. Sin embargo, un proceso controlado de polimerización de proteínas siempre es un desafío. Aquí, hemos desarrollado una metodología enzimática para la construcción de proteínapolis polimerizadas paso a paso en una secuencia racionalmente controlada. En este método, el C-terminus de un monómero proteico es NGL para la conjugación de proteínas utilizando OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mientras que el N-terminus era un teV escleable (virus de grabado de tabaco) sitio más una L (ENLYFQ/GL) para la protección temporal N-terminal. En consecuencia, OaAEP1 fue capaz de añadir sólo un monómero proteico a la vez, y luego la proteasa TEV cortó el N-terminus entre Q y G para exponer el NH2-Gly-Leu. Entonces la unidad está lista para la próxima ligadura OaAEP1. La poliproteína de ingeniería se examina mediante el desarrollo de un dominio de proteína individual utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SMFS). Por lo tanto, este estudio proporciona una estrategia útil para la ingeniería de poliproteínas y la inmovilización.

Introduction

En comparación con los polímeros sintéticos, las proteínas naturales multidominio tienen una estructura uniforme con un número bien controlado y tipo de subdominios1. Esta característica generalmente conduce a una mejor función biológica y estabilidad2,3. Se han desarrollado muchos enfoques, como el acoplamiento de enlace de disulfuro a base de cisteína y la tecnología de ADN recombinante, para la construcción de una proteína polimerizada de este tipo con múltiples dominios4,5,6,7. Sin embargo, el método primero siempre resulta en una secuencia aleatoria e incontrolada, y el segundo conduce a otros problemas, incluyendo la dificultad para la sobreexpresión de proteínas tóxicas y de gran tamaño y la purificación de proteínas complejas con cofactor y otras enzimas delicadas.

Para hacer frente a este reto, desarrollamos un método enzimático que conjuga el monómero proteico para polímero/poliproteína de manera escalonada utilizando una ligasa proteica OaAEP1 combinada con una proteasa TEV8,9. OaAEP1 es una endopeptidasa estricta y eficiente. Dos proteínas pueden vincularse covalentemente como secuencia Asn-Gly-Leu (NGL) a través de dos termini por OaAEP1 en menos de 30 min si el N-terminus es residuos de Gly-Leu (GL) y el otro de los cuales el C-terminus es residuos de NGL10. Sin embargo, el uso de OaAEP1 sólo para vincular monómero de proteína conduce a un polímero proteico con una secuencia incontrolada como el método de acoplamiento basado en cisteína. Por lo tanto, diseñamos el N-terminus de la unidad de proteína con un sitio de proteasa TEV extraíble más un residuo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes de la escisión TEV, el N-terminal no participaría en la ligadura OaAEP1. Y luego los residuos de GL en N-terminus, que son compatibles con la ligadura OaAEP1 adicional, se expone después de la escisión TEV. Así, hemos logrado un método secuencial de biosíntesis enzimática de poliproteína con una secuencia relativamente bien controlada.

Aquí, nuestro método de síntesis enzimática escalonada se puede utilizar en la preparación de muestras de poliproteínas, incluyendo controlado por secuencia e incontrolado, e inmovilización de proteínas para estudios de una sola molécula, especialmente para el sistema complejo como metaloproteína.

Además, los experimentos SMFS basados en AFM nos permiten confirmar la construcción y estabilidad de polímeros proteicos a nivel de una sola molécula. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula, incluyendo AFM, pinza óptica y pinza magnética, es una herramienta general en nanotecnología para manipular la biomolécula mecánicamente y medir su estabilidad11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. El AFM monomolécula ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la proteína (un)folding21,22,23,24,25, la medición de la fuerza de la interacción receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, enlace químico inorgánico20,36,37,38,39,40,41,42,43 y el enlace metal-ligand en metalloproteína44,45,46,47,48,49,50 . Aquí, El AFM de una sola molécula se utiliza para verificar la secuencia de poliproteína sintetizada basada en la señal de despliegue de proteínas correspondiente.

Protocol

1. Producción de proteínas Clon genético Comprar genes que codifican para la proteína de interés (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, el módulo de unión a la celulosa (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) y cohesión de Ruminococcus flavefaciencia, virus de la fjma ción tabaco (TEV) proteasa, polipéptidos similares a la elastina (ELP). Realizar la reacción en cadena de la polimerasa y utilizar el sistema enzimático de digestión de t…

Representative Results

Los residuos NGL introducidos entre proteínas adyacentes por la ligadura OaAEP1 no afectarán a la estabilidad del monómero de proteína en el polímero, ya que la fuerza de despliegue (<Fu>) y el incremento de la longitud del contorno (<Lc>) es comparable con el estudio anterior(Figura 1). El resultado purificador de la proteína rubredoxina se muestra en la Figura 2. Para probar la proteína después de la escisión TEV es compatible co…

Discussion

Hemos descrito un protocolo para la biosíntesis enzimática y la inmovilización de poliproteínas y verificado el diseño de poliproteínas por AFM-basado SMFS. Esta metodología proporciona un enfoque novedoso para construir el polímero de proteína en una secuencia diseñada, que complementa los métodos anteriores para la ingeniería poliproteica y la inmovilización4,6,52,53,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) y el Programa Shuangchuang de la provincia de Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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