Summary

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

Abstract

Chemische en bio-vervoegingstechnieken zijn de laatste jaren snel ontwikkeld en maken het mogelijk om eiwitpolymeren op te bouwen. Echter, een gecontroleerd eiwit polymerisatie proces is altijd een uitdaging. Hier hebben we een enzymatische methodologie ontwikkeld voor het stapsgewijs construeren van gepolymeriseerde eiwitten in een rationeel gecontroleerde sequentie. Bij deze methode is het C-eindpunt van een eiwitmonomeer NGL voor eiwitvervoeging met oaaep1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), terwijl het N-terminus een cleavable TEV (tabaksetch virus) decolletésite plus een L (ENLYFQ/GL) voor tijdelijke N-terminal bescherming was. Bijgevolg kon OaAEP1 slechts één eiwitmonomeer tegelijk toevoegen, waarna de TEV protease het N-terminus tussen Q en G afhakte om de NH2-Gly-Leu bloot te leggen. Dan is het apparaat klaar voor de volgende OaAEP1 ligatie. Het gemanipuleerde polyproteïne wordt onderzocht door het ontvouwen van individueel eiwitdomein met behulp van atomaire kracht microscopie-gebaseerde single-molecule kracht spectroscopie (AFM-SMFS). Daarom biedt deze studie een nuttige strategie voor polyproteïnetechniek en immobilisatie.

Introduction

Vergeleken met synthetische polymeren hebben natuurlijke multi-domein eiwitten een uniforme structuur met een goed gecontroleerd aantal en type subdomeinen1. Deze functie leidt meestal tot een verbeterde biologische functie en stabiliteit2,3. Veel benaderingen, zoals cysteïnegebaseerde disulfide bindingkoppeling en recombinante DNA-technologie, zijn ontwikkeld voor het bouwen van een dergelijk gepolymeriseerd eiwit met meerdere domeinen4,5,6,7. Echter, de voormalige methode resulteert altijd in een willekeurige en ongecontroleerde sequentie, en de laatste leidt tot andere problemen, met inbegrip van de moeilijkheid voor de overexpressie van giftige en grote eiwitten en de zuivering van complexe eiwitten met cofactor en andere delicate enzymen.

Om deze uitdaging aan te gaan, ontwikkelen we een enzymatische methode die eiwitmonomeer samenvoegt voor polymeer/polyproteïne op een stapsgewijze manier met behulp van een eiwitligase OaAEP1 gecombineerd met een protease TEV8,9. OaAEP1 is een strikte en efficiënte endopeptidase. Twee eiwitten kunnen in minder dan 30 min als Asn-Gly-Leu-sequentie (NGL) door twee termini van OaAEP1 in minder dan 30 min worden gekoppeld als het N-terminus gly-leuresiduen (GL) en de andere daarvan NGL-residuen10. Het gebruik van OaAEP1 leidt echter alleen om eiwitmonomeer te koppelen tot een eiwitpolymeer met een ongecontroleerde sequentie zoals de op cysteïne gebaseerde koppelingsmethode. Daarom ontwerpen we het N-eindpunt van de eiwiteenheid met een verwijderbare TEV protease site plus een leucine residu als ENLYFQ/G-L-POI. Vóór het TEV-decolleté zou de N-terminal niet deelnemen aan OaAEP1 ligatie. En dan worden de GL-resten bij N-terminus, die compatibel zijn met verdere OaAEP1-ligatie, blootgesteld na het TEV-decolleté. Zo hebben we een sequentiële enzymatische biosynthesemethode van poly-eiwit bereikt met een relatief goed gecontroleerde sequentie.

Hier kan onze stapsgewijze enzymatische synthesemethode worden gebruikt in polyproteïnemonsterbereiding, inclusief sequentiegestuurd en ongecontroleerd, en eiwitimmobilisatie voor enkelmolecuulstudies, vooral voor het complexe systeem zoals metalloproteïne.

Bovendien stellen afm-gebaseerde SMFS-experimenten ons in staat om de constructie en stabiliteit van het eiwitpolymeer op het niveau van één molecuul te bevestigen. Single-molecule krachtspectroscopie, met inbegrip van AFM, optische pincet en magnetische pincet, is een algemeen instrument in nanotechnologie om biomolecule mechanisch te manipuleren en hun stabiliteit te meten11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM is veel gebruikt in de studie van eiwit (on)vouwen21,22,23,24,25, de sterkte meting van receptor-ligand interactie26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 en metaalligand binding in metalloproteïne44,45,46,47,48,49,50 . Hier wordt single-molecule AFM gebruikt om de gesynthetiseerde polyproteïnesequentie te verifiëren op basis van het bijbehorende eiwitontvouwende signaal.

Protocol

1. Eiwitproductie Genkloon Aankoopgenen codering voor het eiwit van belang (POI): Ubiquitine, Rubredoxin (RD)51, de cellulose-bindende module (CBM), dockerin-X domein (XDoc) en cohesie van Ruminococcus flavefacience, tabak etch virus (TEV) protease, elastine-achtige polypeptiden (ELP’s). Voer polymerase kettingreactie uit en gebruik drie-beperking spijsverteringsenzymsysteem BamHI-BglII-KpnI voor het recombineren …

Representative Results

De NGL-residuen die door OaAEP1-ligatie tussen aangrenzende eiwitten worden geïntroduceerd, hebben geen invloed op de eiwitmonomeerstabiliteit in het polymeer, aangezien de uitvouwkracht (<Fu>), en contourlengtetoename (<ΔLc>) vergelijkbaar is met de vorige studie (figuur 1). Het zuiveringsresultaat van het rubredoxine-eiwit wordt weergegeven in figuur 2. Om te bewijzen dat het eiwit na TEV decolleté compatibel is met de volgende OaAEP1 …

Discussion

We hebben een protocol beschreven voor enzymatische biosynthese en immobilisatie van polyproteïne en geverifieerd de poly-eiwit ontwerp door AFM-gebaseerde SMFS. Deze methodologie biedt een nieuwe benadering voor het bouwen van het eiwitpolymeer in een ontworpen sequentie, die een aanvulling vormt op eerdere methoden voor polyproteïnetechniek en immobilisatie4,6,52,53,<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) en Shuangchuang Programma van de provincie Jiangsu.

Materials

iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8 (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1 (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41 (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10 (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139 (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8 (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13 (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1 (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11 (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12 (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19 (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58 (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9 (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11 (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3 (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39 (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. i. J., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134 (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139 (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9 (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52 (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30 (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57 (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29 (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O’Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49 (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27 (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2 (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116 (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).

Play Video

Cite This Article
Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

View Video