التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك
Summary
نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.
Abstract
نحن وصف تقنيه لوضع العلامات إلى الوراء من الخلايا العصبية الحركية في دروفيبيلا. نستخدم صبغه زيتية ذائبه بالزيت ونقدم قطره صغيره إلى اعداد الشرائح الجنينية بواسطة الحاقن المجهري. يمكن بعد ذلك تسميه كل الخلايا العصبية الحركية التي يتم الاتصال بها بواسطة القطيرات بسرعة. يتم تسميه الخلايا العصبية الحركية الفردية بشكل مستمر ، مما يتيح التفاصيل الهيكلية الدقيقة ليتم تصورها بوضوح. النظر إلى ان الاصباغ محبه للدهون تاتي في ألوان مختلفه ، وتقنيه يوفر أيضا وسيله للحصول علي الخلايا العصبية المجاورة المسمية في متعدد ألوان. التالي فان تقنيه التتبع هذه مفيده لدراسة نشاه الخلايا العصبية والاتصال المتشابك في نظام الخلايا العصبية الحركية من دروفويلا.
Introduction
يوفر نظام الخلايا العصبية الجنينية للمحركات نموذجا تجريبيا قويا لتحليل أليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. نظام الخلايا العصبية الحركية قابل للتقنيات البيوكيميائية والجينية والتصويرية والكهربية. باستخدام التقنيات ، يمكن اجراء التلاعب الجيني والتحليلات الوظيفية علي مستوي الخلايا العصبية أحاديه المحرك2،4،5،6.
خلال التطور المبكر للجهاز العصبي ، والانفجارات العصبية الانقسام وتوليد عدد كبير من الخلايا العصبية والعصبية. وقد تم التحقيق سابقا في العلاقة المكانية بين الفصل والتعريف الجيني للتعبيرات العصبية في التفاصيل7،8،9. في حاله نظام الخلايا العصبية الحركية ، تمت دراسة تشكيل الوصلة العصبية العضلية الجنينية (nmj) علي نطاق واسع باستخدام aCC (خليه الزاوية الاماميه) ، RP2 (الجمبري الخام 2) ، والخلايا العصبية RP5 موتور2،10. علي سبيل المثال ، عندما تشكل الخلايا العصبية الحركية RP5 تقاطع متشابك الوليدة ، يتم مزج filدستور قبل متشابك وبعد متشابك11،12،13. مثل هذه الاتصالات الخلوية المباشرة أمر حيوي للبدء في تشكيل NMJ. علي عكس ما نعرفه عن فروع العصب المحيطيه ، معرفتنا كيف المحرك تشعبات بدء الاتصال متشابك داخل الاجهزه العصبية الخاصة لا تزال بدائية.
في هذا التقرير ، نقدم تقنيه تسمح بوضع العلامات الارتجاعية للخلايا العصبية الحركية في الاجنه عن طريق تقديم الاصباغ المضادة للدهون بواسطة الماصات المجهرية. هذه التقنية تمكننا من تتبع الخلايا العصبية الحركية 38 العصب كل من عضلات جدار الجسم 30 في الجزء هيمي في 15 ح بعد وضع البيض (AEL)14. باستخدام هذه التقنية ، وقد حققت مجموعتنا بدقه العديد من المكاسب من وظيفة/فقدان الوظيفة الاليلات15،16،17. وقد كشفنا مؤخرا أليات الجزيئية التي تدفع بدء الاتصال تغصن المحرك وأظهرت ان التفاعل Dscam1-قفص-باك يعرف موقع النمو تغصن في الخلايا العصبية الحركية aCC17. بشكل عام ، هذه التقنية قابله للتكيف مع التحليل الظاهري لأي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في السلالات البرية أو المتحولة ، مما يعزز قدرتنا علي توفير رؤى جديده في التصميم الوظيفي للجهاز العصبي دروفويلا .
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الوسم صبغ لدراسة المورفولوجية العصبية لديها العديد من المزايا علي تقنيات الخلايا الوراثية وسم. يمكن لتقنية وضع العلامات صبغ تقليل مقدار الوقت اللازم لوضع العلامات والتصوير من مورفولوجيس من الخلايا العصبية الحركية. عمليه وضع العلامات صبغ سريع جدا لأنه ياخذ اقل من 2 ح وتمكننا من تح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر كامياما علي التعليقات علي المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 NS107558 (إلى M.I. ، K.B. ، و دي).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
