Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme
Summary
Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.
Abstract
Biz Drosophilamotor nöronların retrograd etiketleme için bir teknik açıklar. Yağda çözünmüş lipophilic boya kullanıyoruz ve mikroenjektör tarafından embriyonik fileto hazırlığına küçük bir damlacık sıyoruz. Membranı damlacıkla temas eden her motor nöron daha sonra hızla etiketlenebilir. Bireysel motor nöronlar sürekli olarak etiketlenir ve ince yapısal detayların net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Lipophilic boyalar çeşitli renklerde gelir göz önüne alındığında, teknik de çok renkli etiketli komşu nöronlar almak için bir araç sağlar. Bu izleme tekniği bu nedenle Drosophilamotor nöron sisteminde nöronal morfogenez ve sinaptik bağlantı incelenmesi için yararlıdır.
Introduction
Drosophila embriyonik motor nöron sistemi merkezi sinir sisteminin gelişiminin altında yatan mekanizmaları analiz etmek için güçlü bir deneysel model sunuyor (CNS)1,2,3. Motor nöron sistemi biyokimyasal, genetik, görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklere uygundur. Teknikler kullanılarak, genetik manipülasyonlar ve fonksiyonel analizler tek motor nöronlar düzeyinde yapılabilir2,4,5,6.
Sinir sisteminin erken gelişimi sırasında, nöroblastlar bölmek ve glia ve nöronların çok sayıda üretmek. Delaminasyon ve nöroblastların gen ekspresyonu profili arasındaki spatiotemporal ilişki daha önce ayrıntılı olarak araştırılmıştır7,8,9. Motor nöron sistemi durumunda, embriyonik nöromüsküler kavşak oluşumu (NMJ) kapsamlı aCC kullanılarak çalışılmıştır (ön köşe hücresi), RP2 (ham karides 2), ve RP5 motor nöronlar2,10. Örneğin, RP5 motor nöron bir doğmakta olan sinaptik kavşak formları, pre-sinaptik ve post-sinaptik filopodia11,12,13. Bu tür doğrudan hücresel iletişim NMJ oluşumunu başlatmak için hayati önem taşımaktadır. Periferik sinir dalları hakkında bildiklerimizin aksine, motor dendritlerin CNS içinde sinaptik bağlantıyı nasıl başlattığına dair bilgimiz hala ilkeldir.
Bu raporda, lipophilic boyaların mikropipet aracılı teslimatı ile embriyolarda motor nöronların retrograd etiketlemesağlayan bir teknik sokuldu. Bu teknik bize 38 motor nöronlar her 30 vücut duvarı kasları bir hemi segmentinde innerve izlemenizi sağlar 15 saat sonra yumurta yumurtlama (AEL)14. Bu tekniği kullanarak, grubumuz iyice çok sayıda kazanç-of-fonksiyon / fonksiyon kaybı alel15,16,17araştırdı. Biz son zamanlarda motor dendrite bağlantısı nın başlatılması sürücü moleküler mekanizmaları çözdük ve bir Dscam1-Dock-Pak etkileşimi aCC motor nöron dendrite outgrowth site tanımlar gösterdi17. Genel olarak, bu teknik vahşi tip veya mutant suşları herhangi bir embriyonik motor nöronların fenotipik analizi için uyarlanabilir, Drosophila sinir sisteminin fonksiyonel tasarımı içine yeni anlayışlar sağlamak için yeteneğimizi artırarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöronal morfolojiyi incelemek için boya etiketlemekullanımının genetik hücre etiketleme tekniklerine göre birçok avantajı vardır. Boya etiketleme tekniği, motor nöronların morfolojilerinin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi en aza indirebilir. Boya etiketleme işlemi 2 saatten az sürer ve nöronal projeksiyonların ana hatlarını tanımlamamızı sağladığından oldukça hızlıdır. Alternatif olarak, bir aCC maya GAL4 transkripsiyon faktörü ifade eden bir GAL4 hattı seçerek aC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz el yazması üzerinde yorum için Kamiyama Lab üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 NS107558 (M.I., K.B., ve D.K.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
