Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen
Summary
We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.
Abstract
We beschrijven een techniek voor het retrograde labelen van motorneuronen in Drosophila. We gebruiken een olie-opgeloste lipofiele kleurstof en leveren een kleine druppel aan een embryonale filet preparaat door een micro injector. Elke motor neuron wiens membraan wordt benaderd door de druppel kan vervolgens snel worden gelabeld. Individuele motorneuronen worden voortdurend gelabeld, waardoor fijne structurele details duidelijk kunnen worden gevisualiseerd. Gezien het feit dat lipofiele kleurstoffen komen in verschillende kleuren, de techniek biedt ook een middel om aangrenzende neuronen gelabeld in Multicolor. Deze traceer techniek is daarom nuttig voor het bestuderen van neuronale morfogenese en synaptische connectiviteit in het motorische neuron systeem van Drosophila.
Introduction
Het embryonale motorische neuron systeem van Drosophila biedt een krachtig experimenteel model om de onderliggende mechanismen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (CNS)1,2,3te analyseren. Het motorische neuron systeem is vatbaar voor biochemische, genetische, beeldvormende en elektrofysiologische technieken. Met behulp van de technieken kunnen genetische manipulaties en functionele analyses worden uitgevoerd op het niveau van de enkelvoudige motorneuronen2,4,5,6.
Tijdens de vroege ontwikkeling van het zenuwstelsel verdelen en genereren neuro blasten een groot aantal gli’s en neuronen. De spatiotemporele relatie tussen de delaminatie en het genexpressie profiel van neuroblasten is eerder onderzocht in detail7,8,9. In het geval van het motorische neuron systeem is de vorming van embryonale neuromusculaire junctie (nmj) uitgebreid bestudeerd met behulp van de aCC (anterieure hoekcel), RP2 (RAW garnalen 2) en RP5 motorneuronen2,10. Bijvoorbeeld, wanneer de RP5 motor neuron vormt een ontluikende synaptische kruising, de vooraf synaptische en post-synaptische filopodia worden vermengd11,12,13. Dergelijke directe cellulaire communicatie is van vitaal belang voor het initiëren van de NMJ-formatie. In tegenstelling tot wat we weten over de perifere zenuw takken, onze kennis van hoe motor dendrites initiëren synaptische connectiviteit binnen het CZS is nog steeds primitief.
In dit rapport presenteren we een techniek die retrograde labeling van motorneuronen in embryo’s mogelijk maakt door middel van micropipet-gemedieerde levering van lipofiele kleurstoffen. Deze techniek stelt ons in staat om de 38 motorneuronen te traceren die elk van de 30 lichaamsspieren in een Hemi-segment innervating op 15 h na het ei leggen (AEL)14. Door gebruik te maken van deze techniek heeft onze groep een grondige onderzoek uitgevoerd naar talrijke gain-of-functie/verlies-van-functie allelen15,16,17. We hebben onlangs de moleculaire mechanismen ontrafeld die de initiatie van de motorische dendriet-connectiviteit aandrijden en aangetoond dat een Dscam1-Dock-pak interactie de plaats van dendriet-uitgroei definieert in de aCC motor neuron17. Over het algemeen is deze techniek aanpasbaar voor de fenotypische analyse van embryonale motorneuronen in wild type-of Mutante stammen, wat ons vermogen om nieuwe inzichten in het functionele ontwerp van het zenuwstelsel van Drosophila te bieden verbetert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van kleurstof labeling voor het bestuderen van neuronale morfologie heeft verschillende voordelen ten opzichte van genetische cel-labeling technieken. De kleurstof etiketterings techniek kan de hoeveelheid tijd die nodig is voor het labelen en beeldvorming van de morfologieën van motorische neuronen minimaliseren. De kleurstof labeling proces is vrij snel als het duurt minder dan 2 h en stelt ons in staat om de omtrek van neuronale projecties definiëren. Als alternatief kan men de aCC motor neuron visualise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Kamiyama Lab voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 NS107558 (naar M.I., K.B., en D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
