Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici
Summary
Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.
Abstract
Descriviamo una tecnica per l’etichettatura retrograda dei motoneuroni in Drosophila. Usiamo un coloranti lipofilo disciolto di olio e forniamo una piccola gocciolina a una preparazione di filetto embrionale da un microiniettore. Ogni neurone motorio la cui membrana viene contattata dalla goccia può quindi essere rapidamente etichettato. I singoli motoneuroni sono continuamente etichettati, consentendo di visualizzare chiaramente i dettagli strutturali fini. Dato che i coloranti lipofili sono disponibili in vari colori, la tecnica fornisce anche un mezzo per ottenere neuroni adiacenti etichettati in multicolore. Questa tecnica di tracciamento è quindi utile per studiare la morfogenesi neuronale e la connettività sinaptica nel sistema dei neuroni motori della Drosophila.
Introduction
Il sistema di motoneuroni embrionali della Drosophila offre un potente modello sperimentale per analizzare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS)1,2,3. Il sistema dei motoneuroni è suscettibile alle tecniche biochimiche, genetiche, di imaging ed elettrofisiologiche. Utilizzando le tecniche, le manipolazioni genetiche e le analisi funzionali possono essere effettuate a livello di singoli motoneuroni2,4,5,6.
Durante lo sviluppo precoce del sistema nervoso, i neuroblasti si dividono e generano un gran numero di glia e neuroni. La relazione spatiotemporale tra la delaminazione e il profilo di espressione genica dei neuroblasti è stata precedentemente studiata nel dettaglio7,8,9. Nel caso del sistema dei motoneuroni, la formazione di giunzione neuromuscolare embrionale (NMJ) è stata ampiamente studiata utilizzando l’aCC (cellula d’angolo anteriore), RP2 (gambero grezzo 2) e i motoneuroni RP52,10. Ad esempio, quando il motoneurone RP5 forma una giunzione sinaptica nascente, la filopodia pre-sinaptica e post-sinaptica viene mescolata11,12,13. Tale comunicazione cellulare diretta è vitale per avviare la formazione di NMJ. Contrariamente a quanto sappiamo sui rami nervosi periferici, la nostra conoscenza di come i dendriti motori avviano la connettività sinaptica all’interno del SNC è ancora primitiva.
In questa relazione, presentiamo una tecnica che permette l’etichettatura retrograda dei motoneuroni negli embrioni attraverso la somministrazione mediata da micropipette di coloranti lipofili. Questa tecnica ci permette di tracciare i 38 motoneuroni innervando ciascuno dei 30 muscoli della parete del corpo in un emi-segmento a 15 h dopo la deposizione delle uova (AEL)14. Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo ha studiato a fondo numerosi atleti di funzione/perdita di funzionealleli 15,16,17. Recentemente abbiamo svelato i meccanismi molecolari che guidano l’avvio della connettività dendrite motoria e dimostrato che un’interazione Dscam1-Dock-Pak definisce il sito di crescita dendrite nel motoneurone aCC17. In generale, questa tecnica è adattabile per l’analisi fenotipica di eventuali motoneuroni embrionali in ceppi di tipo selvatico o mutanti, migliorando la nostra capacità di fornire nuove intuizioni sulla progettazione funzionale del sistema nervoso della Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’uso dell’etichettatura dei coloranti per studiare la morfologia neuronale ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche di etichettatura delle cellule genetiche. La tecnica di etichettatura dei colori può ridurre al minimo il tempo necessario per etichettare e immaginare le morfologie dei motoneuroni. Il processo di etichettatura del colore è abbastanza veloce in quanto ci vuole meno di 2 h e ci permette di definire il contorno delle proiezioni neuronali. In alternativa, si può visualizzare il neurone motore aCC scegli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del Kamiyama Lab per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. e D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
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