Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей
Summary
Мы описываем метод ретроградного отслеживания дрозофилэмбриональных моторных нейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей.
Abstract
Мы описываем технику ретроградной маркировки моторных нейронов в Дрозофиле. Мы используем растворенный маслом липофильный краситель и доставляем небольшую капельку в эмбриональную подготовку филе микроинжетором. Каждый моторный нейрон, мембрана которого контактирует с каплей, может быть быстро помечен. Индивидуальные моторные нейроны постоянно маркируются, что позволяет четко визуализировать детали конструкций. Учитывая, что липофильные красители бывают различных цветов, техника также обеспечивает средства, чтобы получить соседние нейроны помечены в многоцветных. Этот метод отслеживания поэтому полезен для изучения нейрональных морфогенеза и синаптической связи в двигательной нейронной системы Drosophila.
Introduction
Эмбриональная двигательная нейронная система Дрозофилы предлагает мощную экспериментальную модель для анализа механизмов, лежащих в основе развития центральной нервной системы (ЦНС)1,2,3. Система моторных нейронов поддается биохимическим, генетическим, визуальным и электрофизиологическим методам. Используя методы, генетические манипуляции и функциональные анализы могут быть проведены на уровне одиночных моторных нейронов2,4,5,6.
Во время раннего развития нервной системы нейробласты делятся и генерируют большое количество глии и нейронов. Пространственно-временной связи между delamination и профиль экспрессии генов нейробластов ранее были исследованы в деталях7,8,9. В случае двигательной нейронной системы, формирование эмбрионального нервно-мышечного соединения (NMJ) было широко изучено с помощью aCC (передняя угловая клетка), RP2 (сырые креветки 2), и RP5 моторных нейронов2,10. Например, когда двигательный нейрон RP5 образует зарождающийся синаптический узел, досинаптический и постсинаптический филоподия переплета11,12,13. Такая прямая сотовая связь имеет жизненно важное значение для инициирования формирования NMJ. Вопреки тому, что мы знаем о периферических нервных ветвей, наши знания о том, как моторные дендриты инициировать синаптические связи в ЦНС по-прежнему примитивным.
В этом отчете мы представляем метод, который позволяет ретроградную маркировку моторных нейронов в эмбрионах с помощью микропипети-опосредованного доставки липофильных красителей. Этот метод позволяет нам проследить 38 моторных нейронов, иннервирующих каждый из 30 мышц стенки тела в геми-сегменте на 15 ч после откладки яиц (AEL)14. Используя эту технику, наша группа тщательно исследовала многочисленные выгоды-оф-функции / потери функции аллелей15,16,17. Недавно мы разгадали молекулярные механизмы, которые управляют инициации соединения двигательного дендрита и показали, что взаимодействие Dscam1-Dock-Pak определяет место развития дендрита в моторном нейроне ACC17. В целом, этот метод адаптируется для фенотипического анализа любых эмбриональных моторных нейронов в диком типе или мутантных штаммов, повышая нашу способность предоставлять новые идеи в функциональном дизайне нервной системы Дрозофилы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование маркировки красителей для изучения морфологии нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с методами генетической маркировки клеток. Техника маркировки красителя может свести к минимуму время, необходимое для маркировки и визуализации морфологий моторных нейронов. Пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Камиямы за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана NIH R01 NS107558 (м.и., К.Б. и Д.К.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
