親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング
Summary
親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。
Abstract
ショウジョウバアラにおける運動ニューロンの逆行標識の手法について説明する。油溶存親油性染料を使用し、マイクロインジェクターによる胚性フィレット製剤に小さな液滴を送出します。膜が液滴によって接触する各運動ニューロンは、その後、迅速に標識することができる。個々の運動ニューロンは連続的に標識され、細かい構造の細部を明確に視覚化することを可能にする。親油性染料は様々な色で来ることを考えると、この技術はまた、多色で標識された隣接するニューロンを得るための手段を提供する。したがって、このトレース技術は、ショウジョウバアラの運動ニューロン系における神経形態形成およびシナプス接続性を研究するのに有用である。
Introduction
ショウジョウバチの胚性運動ニューロンシステムは、中枢神経系(CNS)1、2、3の発達の基礎となるメカニズムを分析するための強力な実験モデルを提供する。運動ニューロンシステムは、生化学的、遺伝的、イメージング、および電気生理学的技術に適しています。技術を用いて、遺伝子操作および機能解析は、単一運動ニューロン2、4、5、6のレベルで行うことができる。
神経系の初期の発達の間に, 神経芽細胞が分裂し、グリアとニューロンの多数を生成します。.神経芽細胞の剥離と遺伝子発現プロファイルとの間の時空間的関係は、以前に詳細に7、8、9で検討されている。運動ニューロン系の場合、胚神経筋接合部(NMJ)の形成は、aCC(前コーナーセル)、RP2(生エビ2)、およびRP5運動ニューロン2、10を用いて広く研究されている。例えば、RP5運動ニューロンが新生シナプス接合部を形成する場合、シナプス前およびシナプス後フィロポディアは11、12、13と混在する。このような直接的な細胞通信は、NMJ形成を開始するために不可欠である。末梢神経枝について私たちが知っていることとは対照的に、モーターデンドライトがCNS内でシナプス接続を開始する方法についての私たちの知識はまだ原始的です。
本報告では、親油性色素のマイクロピペット媒介送を用いて胚における運動ニューロンの逆行標識を可能にする技術を提示する。この技術により、産卵後15時間で30個の体壁筋肉のそれぞれを15時間でヘミセグメントにインジェインする38個の運動ニューロンをトレースすることができます(AEL)14.この技術を用いることで、当社のグループは多数の機能獲得/機能喪失アレス15、16、17を徹底的に調査しました。我々は最近、運動デンドライト接続の開始を駆動する分子機構を解明し、Dscam1-Dock-Pak相互作用がaCC運動ニューロン17における樹状突起伸の部位を定義することを実証した。一般に、この技術は、野生型または変異型株における任意の胚性運動ニューロンの表現型解析に適応可能であり、ショウジョウバエ神経系の機能設計に関する新しい洞察を提供する能力を高める。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経形態を研究するための色素標識の使用は、遺伝的細胞標識技術よりもいくつかの利点を有する。色素標識技術は、運動ニューロンの形態を標識およびイメージングするために必要な時間を最小限に抑えることができます。色素標識プロセスは2時間未満で、神経突起の輪郭を定義できるので非常に高速です。あるいは、aCCで酵母GAL4転写因子を発現するGAL4線を選択し、上流活性化配列(UAS)21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
神山研究室の皆様に、原稿に関するご意見をお寄せいただき、ありがとうございます。この作品は、NIH R01 NS107558(M.I.、K.B.、およびD.K.)によってサポートされました。
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
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