מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט
Summary
אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.
Abstract
אנו מתארים טכניקה לנסיגה של הנוירונים מוטוריים בדרוסופילה. אנו משתמשים בדיו מומס שמן ולספק droplet קטן להכנת פילה עובריים על ידי מיקרומזרק. כל תא העצב מנוע שהקרום שלו נוצר על ידי ה-droplet יכול להיות מתויג במהירות. מנוע נוירונים בודדים מתויג ברציפות, המאפשר פרטים מבניים עדינים להיות דמיינו בבירור. בהינתן כי הצבעים ליפופילית מגיעים בצבעים שונים, הטכניקה מספקת גם אמצעי לקבל הנוירונים סמוכים המסומנים בצבע רב. טכניקת העקיבה הזאת שימושית לצורך לימוד מורפולגנזה וקישוריות סינפטית במערכת העצב המוטורית של דרוזוהילה.
Introduction
מערכת העצב המוטורית העובריים של דרוסופילה מציעה מודל ניסיוני רב-עוצמה כדי לנתח את המנגנונים שבבסיס הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית (cn)1,2,3. מערכת העצב המוטורית היא קלה לטכניקות ביוכימיות, גנטיות, דימות ואלקטרופיזיולוגיה. באמצעות טכניקות, מניפולציות גנטיות וניתוחים פונקציונליים ניתן לבצע ברמת הנוירונים מנוע יחיד2,4,5,6.
במהלך ההתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים, הפער המפורז ויצירת מספר רב של גליה ונוירונים. מערכת היחסים הטמפורלית בין הדלאמנציה לבין ביטוי הגנים פרופיל של neuroblasts נחקרו בעבר בפירוט7,8,9. במקרה של מערכת תא העצב מנוע, היווצרות של הצומת העצבי העובריים (NMJ) נחקרו בהרחבה באמצעות aCC (תא בפינה הקדמית), RP2 (סרטנים גולמיים 2), ו RP5 מוטוריים נוירונים2,10. למשל, כאשר תא העצב המוטורי RP5 מהווה צומת סינפטיות המתהווה, הפרה-סינפטית ופוסט-סינפטית התערבבו בין11,12,13. תקשורת סלולרית ישירה כזו חיונית ליזום את היווצרות NMJ. בניגוד למה שאנחנו יודעים על הענפים העצביים ההיקפית, הידע שלנו איך הדנדריטים מוטוריים ליזום קישוריות סינפטית בתוך ה-CN הוא עדיין פרימיטיבי.
בדו ח זה, אנו מציגים טכניקה המאפשרת התיוג נסיגה של נוירונים מוטוריים העוברים באמצעות מיקרופיפטה-תיווך משלוח של צבעי ליפוליים. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר 38 הנוירונים מנוע innervating כל אחד 30 שרירי הקיר הגוף בפלח חמי ב 15 h לאחר הנחת ביצה (ח. א.)14. על-ידי שימוש בטכניקה זו, הקבוצה שלנו חקרה ביסודיות מספר רב של כולל של הפונקציה/אובדן של התפקוד הכולל,15,16,17. לאחרונה יש לנו את המנגנונים המולקולריים כי הכונן ייזום של קישוריות מוטורית של דנדריטים והפגינו כי Dscam1-Dock-פאק האינטראקציה מגדירה את האתר של דנדריטים מוצלח בתוך תא מנוע aCC17. באופן כללי, טכניקה זו היא להתאמה לניתוח פנוטיפ של כל הנוירונים מוטוריים מתחלקים בסוג פראי או זנים מוטציה, שיפור היכולת שלנו לספק תובנות חדשות לתוך העיצוב הפונקציונלי של מערכת העצבים Drosophila ילה .
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בתיוג צבע ללימוד מורפולוגיה עצבית יש מספר יתרונות על טכניקות גנטיות של תיוג תאים. הטכניקה תיוג צבע יכול למזער את כמות הזמן הדרוש לתיוג והדמיה של מורפולוגיות של נוירונים מוטוריים. תהליך תיוג הצבע הוא מהיר למדי כפי שלוקח פחות מ 2 h ומאפשר לנו להגדיר את המתאר של התחזיות הנוירואליות. כחל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת קמיאיאמה על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R01 NS107558 (למ, K.B. ו-D.K.).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
