Summary

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Published: March 08, 2020
doi:

Summary

نقدم بروتوكولا باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب لتحديد وقياس الدهون الخلوية الرئيسية في saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة للتقييم الكمي لفئات الدهون الرئيسية داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة.

Abstract

الدهون هي جزيئات أمفيباثيك متنوعة هيكليا التي هي غير قابلة للذوبان في الماء. الدهون هي المساهمين الأساسيين في تنظيم وظيفة الأغشية البيولوجية، وتخزين الطاقة والإنتاج، والإشارات الخلوية، والنقل المركبات من البروتينات، والتكوين الحيوي organelle، والموت الخلايا المنظمة. لأن الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae هو eukaryote أحادي الخلية قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة، وساعد استخدامه ككائن حي نموذجي في الكشف عن آليات ربط استقلاب الدهون والنقل داخل الخلايا إلى العمليات البيولوجية المعقدة داخل الخلايا eukaryotic. إن توفر طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للفئات الرئيسية من الدهون داخل خلية الخميرة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى عميقة في هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا لاستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي المترادف (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae. طريقة LC-MS/MS الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وقياس كمية العديد من الأنواع (بما في ذلك أشكال مختلفة من الايزوباريك أو الايزوميري) داخل كل فئة من فئات الدهون العشرة. وهذه الطريقة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض أنواع الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.2 pmol/μL. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لتقييم الدهون من خلايا الخميرة الكاملة والعضيات المنقى. ويمكن أن يؤدي استخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي للرذاذ الكهربائي في هذه الطريقة إلى زيادة كفاءة التأيين بالنسبة لبعض أنواع الدهون، وبالتالي يمكن استخدامه لتحسين تحديدها وكميتها.

Introduction

تشير مجموعة من الأدلة إلى أن الدهون ، وهي واحدة من الفئات الرئيسية للجزيئات الحيوية ، تلعب أدوارًا أساسية في العديد من العمليات الحيوية داخل خلية eukaryotic. وتشمل هذه العمليات تجميع ثنائيات الدهون التي تشكل غشاء البلازما والأغشية المحيطة العضيات الخلوية، ونقل جزيئات صغيرة عبر أغشية الخلايا، والاستجابة للتغيرات في البيئة خارج الخلية ونقل إشارة داخل الخلايا، وتوليد وتخزين الطاقة، واستيراد وتصدير البروتينات تقتصر على العضيات المختلفة، والاتجار بالمركبات من البروتينات داخل نظام الغشاء الداخلي وإفراز البروتين، وعدة طرق من موت الخلية المنظمة1 ،2،3،4،5،6،7،8،9،10.

الخميرة الناشئة S. cerevisiae، كائن eukaryotic وحيدة الخلية ، وقد استخدمت بنجاح للكشف عن بعض الآليات الكامنة وراء الأدوار الأساسية للدهون في هذه العمليات الخلوية الحيوية4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ،16،17،18،19،20. S. cerevisiae هو كائن حي نموذجي قيم للكشف عن هذه الآليات لأنه قابل للتحليلات الشاملة الكيميائية الحيوية والوراثية والخلايا البيولوجية والبيولوجية الكيميائية والبيولوجية النظامية والدقيقة السوائل تشريحالتحاليل 21،22،23،24،25. مزيد من التقدم في آليات فهم الدهون التي من خلالها التمثيل الغذائي للدهون والنقل داخل الخلايا المساهمة في هذه العمليات الخلوية الحيوية يتطلب تقنيات قياس الطيف الكتلي الحساسة للتوصيف الكميللدهون الخلوية، وفهم التعقيد الجزيئي للدهون، ودمج الدهون الكمية في منصة متعددة التخصصات للأنظمة البيولوجيا26، 27،28،29،30.

الأساليب الحالية لقياس الطيف الكتلي بمساعدة الدهون الكمية من خلايا الخميرة وخلايا الكائنات الحية eukaryotic الأخرى ليست متعددة بما فيه الكفاية، قوية، أو حساسة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب المستخدمة حاليا غير قادرة على التمييز بين مختلف أنواع الدهون الأيزوباروية أو الأيزوميريك ية عن بعضها البعض. هنا نصف طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة تسمح باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام العقيمة لعبادة الخميرة إعداد 90 مل من وسط YP كاملة تحتوي على 1٪ (ث / v) استخراج الخميرة و 2٪ (ث / v) bactopeptone. إعداد 90 مل من متوسط YNB الاصطناعية الحد الأدنى التي تحتوي على 0.67٪ (ث / v) قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية، 20 ملغ / لتر-الهستيدين، 30 ملغ / لتر</e…

Representative Results

كانت طريقتنا للتقييم الكمي للدهون الخلوية الرئيسية داخل خلية الخميرة بمساعدة LC-MS/MS متعددة الاستخدامات وقوية. سمح لنا لتحديد وتحديد كمية 10 فئات الدهون المختلفة في S. cerevisiae الخلايا المستزرعة في المتوسط الاصطناعية الحد الأدنى YNB التي تحتوي في البداية 2٪ الجلوكوز. وتشمل …

Discussion

الاحتياطات التالية مهمة للتنفيذ الناجح للبروتوكول الموصوف هنا:

1. الكلوروفورم والميثانول سامة. أنها استخراج بكفاءة مواد مختلفة من الأسطح، بما في ذلك البلاستيك المختبري ة وبشرتك. لذلك ، تعامل مع هذه المذيبات العضوية بحذر عن طريق تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو لإجراء المناقشات. ونحن نقدر مركز التطبيقات البيولوجية للقياس الطيفي الكتلي ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي (وكلاهما في جامعة كونكورديا) على الخدمات المتميزة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية (NSERC) في كندا (RGPIN 2014-04482) وصندوق كرسي جامعة كونكورديا (CC0113). وحاز ك. م. على دعم من جائزة الجدارة في جامعة كونكورديا.

Materials

15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
2-Propanol Fisher Scientific A461-500
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Agilent1100 Wellplate Agilent Technologies G1367A
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Ammonium formate Fisher Scientific A11550
Ammonium hydroxide Fisher Scientific A470-250
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Ceramide Avanti Polar Lipids 860517
Chloroform Fisher Scientific C297-4
CSH C18 VanGuard Waters 186006944 Pre-column system
Free fatty acid (19:0) Matreya 1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) Sigma-Aldrich G8772
Glucose Fisher Scientific D16-10
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
L-histidine Sigma H8125
Lipid Search software (V4.1) Fisher Scientific V4.1 LC-MS/MS analysis software
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850340
Phosphatidylethanolamine Avanti Polar Lipids 850704
Phosphatidylglycerol Avanti Polar Lipids 840446
Phosphatidylinositol Avanti Polar Lipids LM1502
Phosphatidylserine Avanti Polar Lipids 840028
Reverse-phase column CSH C18 Waters 186006102
Sphingosine Avanti Polar Lipids 860669
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Tricylglycerol Larodan, Malmo TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Uracil Sigma U0750
Vortex Fisher Scientific 2215365
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids Fisher Scientific DF0919-15-3
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

References

  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  3. Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
  6. Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
  7. Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
  8. Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
  9. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  10. Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
  11. Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
  12. Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
  13. Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
  14. Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
  15. Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
  16. Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
  17. Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
  18. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
  19. Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
  20. Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
  21. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  22. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  23. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  24. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  25. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
  26. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  27. Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
  28. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  29. Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
  30. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  31. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
  32. Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).

Play Video

Cite This Article
Mohammad, K., Jiang, H., Hossain, M. I., Titorenko, V. I. Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60616, doi:10.3791/60616 (2020).

View Video