التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب
Summary
نقدم بروتوكولا باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب لتحديد وقياس الدهون الخلوية الرئيسية في saccharomyces cerevisiae. الطريقة الموصوفة للتقييم الكمي لفئات الدهون الرئيسية داخل خلية الخميرة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة.
Abstract
الدهون هي جزيئات أمفيباثيك متنوعة هيكليا التي هي غير قابلة للذوبان في الماء. الدهون هي المساهمين الأساسيين في تنظيم وظيفة الأغشية البيولوجية، وتخزين الطاقة والإنتاج، والإشارات الخلوية، والنقل المركبات من البروتينات، والتكوين الحيوي organelle، والموت الخلايا المنظمة. لأن الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae هو eukaryote أحادي الخلية قابلة للتحليلات الجزيئية الشاملة، وساعد استخدامه ككائن حي نموذجي في الكشف عن آليات ربط استقلاب الدهون والنقل داخل الخلايا إلى العمليات البيولوجية المعقدة داخل الخلايا eukaryotic. إن توفر طريقة تحليلية متعددة الاستخدامات للتقييم الكمي القوي والحساس والدقيق للفئات الرئيسية من الدهون داخل خلية الخميرة أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى عميقة في هذه الآليات. هنا نقدم بروتوكولا لاستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي المترادف (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae. طريقة LC-MS/MS الموصوفة متعددة الاستخدامات وقوية. وهو يتيح تحديد وقياس كمية العديد من الأنواع (بما في ذلك أشكال مختلفة من الايزوباريك أو الايزوميري) داخل كل فئة من فئات الدهون العشرة. وهذه الطريقة حساسة وتسمح بتحديد وكمية بعض أنواع الدهون بتركيزات منخفضة إلى 0.2 pmol/μL. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لتقييم الدهون من خلايا الخميرة الكاملة والعضيات المنقى. ويمكن أن يؤدي استخدام إضافات المرحلة المتنقلة البديلة لقياس الطيف الكتلي للرذاذ الكهربائي في هذه الطريقة إلى زيادة كفاءة التأيين بالنسبة لبعض أنواع الدهون، وبالتالي يمكن استخدامه لتحسين تحديدها وكميتها.
Introduction
تشير مجموعة من الأدلة إلى أن الدهون ، وهي واحدة من الفئات الرئيسية للجزيئات الحيوية ، تلعب أدوارًا أساسية في العديد من العمليات الحيوية داخل خلية eukaryotic. وتشمل هذه العمليات تجميع ثنائيات الدهون التي تشكل غشاء البلازما والأغشية المحيطة العضيات الخلوية، ونقل جزيئات صغيرة عبر أغشية الخلايا، والاستجابة للتغيرات في البيئة خارج الخلية ونقل إشارة داخل الخلايا، وتوليد وتخزين الطاقة، واستيراد وتصدير البروتينات تقتصر على العضيات المختلفة، والاتجار بالمركبات من البروتينات داخل نظام الغشاء الداخلي وإفراز البروتين، وعدة طرق من موت الخلية المنظمة1 ،2،3،4،5،6،7،8،9،10.
الخميرة الناشئة S. cerevisiae، كائن eukaryotic وحيدة الخلية ، وقد استخدمت بنجاح للكشف عن بعض الآليات الكامنة وراء الأدوار الأساسية للدهون في هذه العمليات الخلوية الحيوية4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ،16،17،18،19،20. S. cerevisiae هو كائن حي نموذجي قيم للكشف عن هذه الآليات لأنه قابل للتحليلات الشاملة الكيميائية الحيوية والوراثية والخلايا البيولوجية والبيولوجية الكيميائية والبيولوجية النظامية والدقيقة السوائل تشريحالتحاليل 21،22،23،24،25. مزيد من التقدم في آليات فهم الدهون التي من خلالها التمثيل الغذائي للدهون والنقل داخل الخلايا المساهمة في هذه العمليات الخلوية الحيوية يتطلب تقنيات قياس الطيف الكتلي الحساسة للتوصيف الكميللدهون الخلوية، وفهم التعقيد الجزيئي للدهون، ودمج الدهون الكمية في منصة متعددة التخصصات للأنظمة البيولوجيا1،2،3،26، 27،28،29،30.
الأساليب الحالية لقياس الطيف الكتلي بمساعدة الدهون الكمية من خلايا الخميرة وخلايا الكائنات الحية eukaryotic الأخرى ليست متعددة بما فيه الكفاية، قوية، أو حساسة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب المستخدمة حاليا غير قادرة على التمييز بين مختلف أنواع الدهون الأيزوباروية أو الأيزوميريك ية عن بعضها البعض. هنا نصف طريقة متعددة الاستخدامات وقوية وحساسة تسمح باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS/MS) للتحليل الكمي للدهون الخلوية الرئيسية لـ S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
الاحتياطات التالية مهمة للتنفيذ الناجح للبروتوكول الموصوف هنا:
1. الكلوروفورم والميثانول سامة. أنها استخراج بكفاءة مواد مختلفة من الأسطح، بما في ذلك البلاستيك المختبري ة وبشرتك. لذلك ، تعامل مع هذه المذيبات العضوية بحذر عن طريق تجنب استخدام البلاستيك في الخطوات التي تنطوي …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر تيتورينكو لإجراء المناقشات. ونحن نقدر مركز التطبيقات البيولوجية للقياس الطيفي الكتلي ومركز الجينوم الهيكلي والوظيفي (وكلاهما في جامعة كونكورديا) على الخدمات المتميزة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث الطبيعية والهندسية (NSERC) في كندا (RGPIN 2014-04482) وصندوق كرسي جامعة كونكورديا (CC0113). وحاز ك. م. على دعم من جائزة الجدارة في جامعة كونكورديا.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
