Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie
Summary
We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.
Abstract
Lipiden zijn structureel diverse amphipathic moleculen die onoplosbaar zijn in water. Lipiden zijn essentiële bijdragen aan de organisatie en functie van biologische membranen, energieopslag en -productie, cellulaire signalering, vesiculaire transport van eiwitten, organelle biogenese, en gereguleerde celdood. Omdat de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is een eencellige eukaryote vatbaar voor grondige moleculaire analyses, het gebruik ervan als een model organisme geholpen onthullen mechanismen koppelen lipide metabolisme en intracellulair vervoer aan complexe biologische processen binnen eukaryotische cellen. De beschikbaarheid van een veelzijdige analytische methode voor de robuuste, gevoelige en nauwkeurige kwantitatieve beoordeling van belangrijke klassen lipiden in een gistcel is cruciaal voor het verkrijgen van diepgaande inzichten in deze mechanismen. Hier presenteren we een protocol om vloeibare chromatografie te gebruiken in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) voor de kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae. De beschreven LC-MS/MS methode is veelzijdig en robuust. Het maakt de identificatie en kwantificering van talrijke soorten (waaronder verschillende isobarische of isomische vormen) binnen elk van de 10 lipideklassen mogelijk. Deze methode is gevoelig en maakt identificatie en kwantificering van sommige lipidesoorten mogelijk bij concentraties tot 0,2 pmol/μL. De methode is met succes toegepast op de beoordeling van lipidomen van hele gistcellen en hun gezuiverde organellen. Het gebruik van alternatieve mobiele faseadditieven voor elektrosprayionisatiemassaspectrometrie in deze methode kan de efficiëntie van ionisatie voor sommige lipidesoorten verhogen en kan daarom worden gebruikt om hun identificatie en kwantificering te verbeteren.
Introduction
Een lichaam van bewijs geeft aan dat lipiden, een van de belangrijkste klassen van biomoleculen, een essentiële rol spelen in vele vitale processen binnen een eukaryotische cel. Deze processen omvatten de assemblage van lipide tweelagen die het plasmamembraan en de membranen rond cellulaire organellen vormen, het vervoer van kleine moleculen over celmembranen, reactie op veranderingen in de extracellulaire omgeving en intracellulaire signaaltransductie, opwekking en opslag van energie, import en export van eiwitten die beperkt zijn tot verschillende organellen, vesiculaire handel in eiwitten binnen het endomembraansysteem en eiwitafscheiding, en verschillende vormen van gereguleerde celdood1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
De ontluikende gist S. cerevisiae, een eencellig eukaryotisch organisme, is met succes gebruikt om een aantal van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de essentiële rollen van lipiden in deze vitale cellulaire processen4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae is een waardevol modelorganisme voor het blootleggen van deze mechanismen omdat het vatbaar is voor uitgebreide biochemische, genetische, celbiologische, chemische biologische, systeembiologische en microfluïdedsectieanalyses21,22,23,24,25. Verdere vooruitgang in het begrijpen van mechanismen waardoor lipidemetabolisme en intracellulair transport bijdragen aan deze vitale cellulaire processen vereist gevoelige massaspectrometrietechnologieën voor de kwantitatieve karakterisering van het cellulaire lipidoom, het begrijpen van de lipidoom moleculaire complexiteit, en het integreren van kwantitatieve lipideomics in een multidisciplinair platform van systeembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.
De huidige methoden voor de massaspectrometrie-ondersteunde kwantitatieve lipidomica van gistcellen en cellen van andere eukaryotische organismen zijn niet voldoende veelzijdig, robuust of gevoelig. Bovendien zijn deze momenteel gebruikte methoden niet in staat om verschillende isobarische of isomeric lipidesoorten van elkaar te onderscheiden. Hier beschrijven we een veelzijdige, robuuste en gevoelige methode die het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) mogelijk maakt voor kwantitatieve analyse van belangrijke cellulaire lipiden van S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volgende voorzorgsmaatregelen zijn belangrijk voor de succesvolle uitvoering van het hier beschreven protocol:
1. Chloroform en methanol zijn giftig. Ze halen efficiënt verschillende stoffen uit oppervlakken, waaronder laboratoriumplasticware en uw huid. Behandel deze organische oplosmiddelen daarom voorzichtig door het gebruik van kunststoffen te vermijden in stappen die contact met chloroform en/of methanol inhouden, met behulp van borosilicaatglaspipetten voor deze stappen, en spoel dez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de huidige en voormalige leden van het Titorenko laboratorium dankbaar voor discussies. Wij erkennen het Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry en het Centre for Structural and Functional Genomics (beide aan de Concordia University) voor uitstekende diensten. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada (RGPIN 2014-04482) en Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. werd ondersteund door de Concordia University Merit Award.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
