JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Published: March 08, 2020
doi:
10.3791/60616
, , ,
1Department of Biology,Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry,Concordia University

Summary

Saccharomyces cerevisiae’dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Abstract

Lipidler suda çözünmez yapısal olarak çeşitli amphipatik moleküllerdir. Lipidler biyolojik membranların organizasyonu ve işlevi, enerji depolama ve üretimi, hücresel sinyalizasyon, proteinlerin veziküler taşınması, organel biyogenezi ve düzenlenmiş hücre ölümü için temel katkıda bulunmaktadır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kapsamlı moleküler analizler için tek hücreli ökaryot münasip olduğundan, model bir organizma olarak kullanımı ökaryotik hücreler içinde karmaşık biyolojik süreçlere lipid metabolizması ve hücre içi taşıma bağlayan mekanizmaları ortaya çıkarmak yardımcı oldu. Bir maya hücresi içindeki büyük lipid sınıflarının sağlam, hassas ve doğru nicel değerlendirilmesi için çok yönlü bir analitik yöntemin bulunması, bu mekanizmalar hakkında derin bilgiler elde etmek için çok önemlidir. Burada S. cerevisiae’nin majör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisi kullanmak için bir protokol salıyoruz. Açıklanan LC-MS/MS yöntemi çok yönlü ve sağlamdır. 10 lipid sınıfının her birinde çok sayıda türün (farklı izobarik veya izometrik formlar dahil) tanımlanmasını ve sayısallaştırılmasını sağlar. Bu yöntem hassastır ve bazı lipid türlerinin 0,2 pmol/μL gibi düşük konsantrasyonlarda tanımlanmasına ve sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Yöntem başarıyla tüm maya hücreleri ve saflaştırılmış organellerin lipidomların değerlendirilmesi için uygulanmıştır. Bu yöntemde elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi için alternatif mobil faz katkı larının kullanılması bazı lipid türleri için iyonlaşma verimliliğini artırabilir ve bu nedenle bunların tanımlanması ve nicelliği artırmak için kullanılabilir.

Introduction

Bir kanıt gövdesi, biyomoleküllerin ana sınıflarından biri olan lipidlerin ökaryotik hücre içindeki birçok hayati süreçte önemli roller oynadığını göstermektedir. Bu süreçler arasında hücre organlarını çevreleyen plazma membran ve membranlar oluşturan lipid iki tabakalarının biraraya edilmesi, küçük moleküllerin hücre zarları arasında taşınması, hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt ve hücre içi sinyal iletimi, enerjinin üretimi ve depolanması, farklı organellere hapsedilmiş proteinlerin ithalat ve ihracatı, endmembran sistemi ve protein salgılanması içinde proteinlerin vesiküler ticareti ve düzenlenmiş hücre ölümü çeşitli modları1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Tomurcuklanan maya S. cerevisiae, tek hücreli ökaryotik organizma, başarıyla bu hayati hücreselsüreçlerdelipidlerin temel rolleri altında yatan mekanizmaların bazılarını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Kapsamlı biyokimyasal, genetik, hücre biyolojik, kimyasal biyolojik, sistem biyolojik ve mikroakışkan diseksiyon analizleri21,22,23,24,25münasip olduğu için S. cerevisiae bu mekanizmaları ortaya çıkarmak için değerli bir model organizmadır. Lipid metabolizması ve hücre içi taşımanın bu hayati hücresel süreçlere katkıda bulunduğu mekanizmaları anlamada daha fazla ilerleme, hücresel lipidomun kantitatif karakterizasyonu, lipidom moleküler karmaşıklığınınanlaşılması ve kantitatif lipidomiklerin sistemlerin çok disiplinli platformuna entegre edilmesi için hassas kütle spektrometresi teknolojileri gerektirir. 27,28,29,30.

Maya hücrelerinin ve diğer ökaryotik organizmaların hücrelerinin kütle spektrometresi destekli nicel lipidomikler için mevcut yöntemler yeterince çok yönlü, sağlam veya hassas değildir. Ayrıca, bu şu anda kullanılan yöntemler birbirinden çeşitli izobarik veya izzosik lipid türleri ayırt etmek mümkün değildir. Burada, S. cerevisiae’ninmajör hücresel lipitlerinin kantitatif analizi için tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile birleşen sıvı kromatografisinin kullanımına olanak tanıyan çok yönlü, sağlam ve hassas bir yöntemi tanımlıyoruz.

Protocol

1. Maya kültüriçin steril ortam hazırlanması % 1 (w / v) maya ekstresi ve% 2 (w / v) bactopeptone içeren tam bir YP orta 90 mL hazırlayın. 90 mL sentetik minimal YNB ortamı içeren 0.67% (w/v) amino asitler olmadan maya azot baz, 20 mg /L -histidin, 30 mg/L L-l -l -lösin, 30 mg/L -l -lizin ve 20 mg/L urasil hazırlayın. Tam YP ortamının 90 mL’sini eşit olarak 250 mL Erlenmeyer şişesine (yani her biri 45 mL) bölün. Sentetik minimal YNB …

Representative Results

LC-MS/MS yardımı ile bir maya hücresi içindeki majör hücresel lipidlerin nicel değerlendirilmesi için yöntemimiz çok yönlü ve sağlamdı. Başlangıçta %2 glikoz içeren sentetik minimal YNB ortamda yetiştirilen S. cerevisiae hücrelerinde 10 farklı lipid sınıfını tanımlamamızı ve ölçmemizi sağladı. Bu lipid sınıfları serbest (estersiz) yağ asitleri (FFA), CL, fitoseramid (PHC), fitosfingosin (PHS), PC, PE, PG, PI, PS ve TAG(Ek Tablo 1)</stro…

Discussion

Burada açıklanan protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için aşağıdaki önlemler önemlidir:

1. Kloroform ve metanol toksiktir. Laboratuvar plastik leri ve cildiniz de dahil olmak üzere yüzeylerden çeşitli maddeleri verimli bir şekilde ayıklar. Bu nedenle, kloroform ve / veya metanol ile temas içeren adımlarda plastik kullanımını kaçınarak dikkatli bu organik çözücüler ele, bu adımlar için borosilikat cam pipetler kullanarak, ve kullanmadan önce kloroform v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Titorenko laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine görüşmeler için müteşekkiriz. Kütle Spektrometresi Biyolojik Uygulamalar Merkezi ve Yapısal ve Fonksiyonel Genomik Merkezi’ni (her ikisi de Concordia Üniversitesi’nde) olağanüstü hizmetler için kabul ediyoruz. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN 2014-04482) ve Concordia Üniversitesi Başkanlık Fonu (CC0113) tarafından desteklenmiştir. K.M. Concordia Üniversitesi Liyakat Ödülü ile desteklendi.

Materials

15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
2-Propanol Fisher Scientific A461-500
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Agilent1100 Wellplate Agilent Technologies G1367A
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Ammonium formate Fisher Scientific A11550
Ammonium hydroxide Fisher Scientific A470-250
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Ceramide Avanti Polar Lipids 860517
Chloroform Fisher Scientific C297-4
CSH C18 VanGuard Waters 186006944 Pre-column system
Free fatty acid (19:0) Matreya 1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) Sigma-Aldrich G8772
Glucose Fisher Scientific D16-10
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
L-histidine Sigma H8125
Lipid Search software (V4.1) Fisher Scientific V4.1 LC-MS/MS analysis software
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850340
Phosphatidylethanolamine Avanti Polar Lipids 850704
Phosphatidylglycerol Avanti Polar Lipids 840446
Phosphatidylinositol Avanti Polar Lipids LM1502
Phosphatidylserine Avanti Polar Lipids 840028
Reverse-phase column CSH C18 Waters 186006102
Sphingosine Avanti Polar Lipids 860669
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Tricylglycerol Larodan, Malmo TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Uracil Sigma U0750
Vortex Fisher Scientific 2215365
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids Fisher Scientific DF0919-15-3
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  3. Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
  6. Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
  7. Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
  8. Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
  9. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  10. Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
  11. Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
  12. Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
  13. Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
  14. Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
  15. Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
  16. Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
  17. Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
  18. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
  19. Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
  20. Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
  21. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
  22. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  23. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  24. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  25. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
  26. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  27. Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
  28. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  29. Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
  30. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  31. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
  32. Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).

Tags

LipidomeSaccharomyces CerevisiaeLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryLipid ExtractionYeast CultureInternal Lipid StandardsQuantitative Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mohammad, K., Jiang, H., Hossain, M. I., Titorenko, V. I. Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60616, doi:10.3791/60616 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image