Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией
Summary
Мы представляем протокол с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для выявления и количественной оценки основных клеточных липидов в Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке является универсальным, надежным и чувствительным.
Abstract
Липиды являются структурно разнообразными молекулами амфипатических, которые нерастворяются в воде. Липиды являются важными факторами, способствующими организации и функционированию биологических мембран, хранению и производству энергии, клеточной сигнализации, везикулярной транспортировке белков, биогенезу органеллы и регулируемой гибели клеток. Поскольку подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae является одноклеточным эукариотом, поддающимся тщательному молекулярным анализам, его использование в качестве модельного организма помогло раскрыть механизмы, связывающие липидный метаболизм и внутриклеточный перенос со сложными биологическими процессами в эукариотических клетках. Наличие универсального аналитического метода для надежной, чувствительной и точной количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке имеет решающее значение для получения глубокого понимания этих механизмов. Здесь мы представляем протокол для использования жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae. Описанный метод LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно многих видов (в том числе различных изобарических или изомерических форм) в рамках каждого из 10 классов липидов. Этот метод является чувствительным и позволяет идентифицировать и количественно некоторых видов липидов в концентрациях до 0,2 моль/Л. Метод успешно применяется для оценки липидоменов цельных дрожжевых клеток и их очищенных органелл. Использование альтернативных мобильных фазовых добавок для масс-спектрометрии электроспрея в этом методе может повысить эффективность ионизации для некоторых видов липидов и поэтому может быть использовандля для улучшения их идентификации и количественной оценки.
Introduction
Совокупность доказательств указывает на то, что липиды, один из основных классов биомолекул, играют важную роль во многих жизненно важных процессах в эукариотической клетке. Эти процессы включают в себя сборку липидных двухслойных, которые составляют плазменную мембрану и мембраны, окружающие клеточные органеллы, транспортировку небольших молекул через клеточные мембраны, реакцию на изменения в внеклеточной среде и внутриклеточной трансдукции сигналов, генерацию и хранение энергии, импорт и экспорт белков, ограниченных различными органеллами, везикулярный оборот белков в системе эндоммраленции и белковой секреции, а также несколько режимов клеточной секреции, а также несколько способов регулирования клеточной секреции клеток1 ,2,3,4,5,7,8,9,10.
Подающий надежды дрожжи S. cerevisiae, одноклеточный эукариотический организм, был успешно использован, чтобы раскрыть некоторые из механизмов, лежащих в основе основных ролей липидов в этих жизненно важных клеточных процессов4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae является ценным моделью организма для раскрытия этих механизмов, поскольку он поддается всеобъемлющей биохимической, генетической, клеточной биологической, химической биологической, системной биологической и микрофлюидной анализы21,22,23,24,25. Дальнейший прогресс в понимании механизмов, с помощью которых липидный метаболизм и внутриклеточный транспорт способствуют этим жизненно важным клеточным процессам, требует чувствительных технологий масс-спектрометрии для количественной характеристики клеточного липидома, понимания молекулярной сложности липидома и интеграции количественной липидоми в многодисциплинарную платформу систем биологии1,2,3,26, 27,28,29,30.
Современные методы массовой спектрометрии при содействии количественной липидоми дрожжевых клеток и клеток других эукариотических организмов не являются достаточно универсальными, надежными или чувствительными. Кроме того, эти используемые в настоящее время методы не способны дифференцировать различные изобарические или изомерные липидные виды друг от друга. Здесь мы описываем универсальный, надежный и чувствительный метод, который позволяет использовать жидкую хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешной реализации протокола, описанного здесь, важны следующие меры предосторожности:
1. Хлороформ и метанол токсичны. Они эффективно извлекают различные вещества из поверхностей, в том числе лабораторную пластичную посуду и кожу. Поэтому, обрабатывать эти органич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы признательны Центру биологического применения массовой спектрометрии и Центру структурной и функциональной геномики (оба при Университете Конкордии) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482) и Фонда кафедры Университета Конкордия (CC0113). К.М. была поддержана премией Университета Конкордии за заслуги.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
