Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem
Summary
Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.
Abstract
Les lipides sont des molécules amphipathiques structurellement diverses qui sont insolubles dans l’eau. Les lipides sont des facteurs essentiels à l’organisation et à la fonction des membranes biologiques, du stockage et de la production d’énergie, de la signalisation cellulaire, du transport vésiculaire des protéines, de la biogenèse d’organelle et de la mort cellulaire réglementée. Parce que la levure naissante Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire favorable à des analyses moléculaires approfondies, son utilisation comme un organisme modèle a aidé à découvrir des mécanismes reliant le métabolisme des lipides et le transport intracellulaire à des processus biologiques complexes dans les cellules eucaryote. La disponibilité d’une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise des grandes classes de lipides au sein d’une cellule de levure est cruciale pour obtenir des connaissances approfondies sur ces mécanismes. Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires principaux de S. cerevisiae. La méthode LC-MS/MS décrite est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de nombreuses espèces (y compris différentes formes isobariques ou isomériques) dans chacune des 10 classes de lipides. Cette méthode est sensible et permet l’identification et la quantitation de certaines espèces lipidiques à des concentrations aussi basses que 0,2 pmol/L. La méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des lipidomes des cellules entières de levure et de leurs organites purifiés. L’utilisation d’additifs alternatifs de phase mobile pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray dans cette méthode peut augmenter l’efficacité de l’ionisation pour certaines espèces lipidiques et peut donc être utilisée pour améliorer leur identification et leur quantitation.
Introduction
Un ensemble de preuves indique que les lipides, l’une des principales classes de biomolécules, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux au sein d’une cellule eucaryote. Ces processus comprennent l’assemblage de bilayers lipidiques qui constituent la membrane plasmatique et les membranes entourant les organites cellulaires, le transport de petites molécules à travers les membranes cellulaires, la réponse aux changements de l’environnement extracellulaire et la transduction intracellulaire du signal, la production et le stockage de l’énergie, l’importation et l’exportation de protéines confinées à différents organites, le trafic vésicular des protéines dans le système endomémbrane et la sécrétion de protéines, et plusieurs modes de la cellule de mort réglementée1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levure en herbe S. cerevisiae, un organisme eucaryote unicellulaire, a été utilisé avec succès pour découvrir certains des mécanismes sous-jacents aux rôles essentiels des lipides dans ces processus cellulaires vitaux4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae est un organisme modèle précieux pour découvrir ces mécanismes parce qu’il est favorable à la biochimie complète, génétique, biologique cellulaire, biologique chimique, biologique du système biologique, et microfluidique dissection analyses21,22,23,24,25. D’autres progrès dans la compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme lipidique et le transport intracellulaire contribuent à ces processus cellulaires vitaux nécessite des technologies sensibles de spectrométrie de masse pour la caractérisation quantitative du lipidome cellulaire, la compréhension de la complexité moléculaire lipidome, et l’intégration de lipidomiques quantitatifs dans une plate-forme multidisciplinaire de biologie des systèmes1,2,3,26, 27,28,29,30.
Les méthodes actuelles pour la lipidomique quantitative de masse assistée par spectrométrie des cellules et des cellules de levure d’autres organismes eucaryotes ne sont pas suffisamment polyvalentes, robustes ou sensibles. En outre, ces méthodes actuellement utilisées sont incapables de différencier diverses espèces de lipides isobariques ou isomériques les unes des autres. Ici, nous décrivons une méthode polyvalente, robuste et sensible qui permet l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires majeurs de S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les précautions suivantes sont importantes pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit ici :
1. Le chloroforme et le méthanol sont toxiques. Ils extraient efficacement diverses substances des surfaces, y compris la plasticware de laboratoire et votre peau. Par conséquent, manipuler ces solvants organiques avec prudence en évitant l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent le contact avec le chloroforme et / ou le méthanol, en utilisant des pipettes en verre bor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous remercions le Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry et le Centre for Structural and Functional Genomics (tous deux de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été appuyée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (NSERC) du Canada (RGPIN 2014-04482) et du Fonds de la chaire de l’Université Concordia (CC0113). K.M. a reçu l’appui du Prix du mérite de l’Université Concordia.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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