Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

En las primeras fases del desarrollo, las piscinas de células progenitoras especializadas se dividen repetidamente en zonas proliferativas, produciendo diversos arreglos de células hijas. Las células nacidas durante este período de desarrollo se diferenciarán y viajarán para formar los órganos nacientes. En el sistema nervioso, los progenitores como la glia radial dan lugar a neuronas inmaduras en zonas ventriculares. A medida que las neuronas se alejan de los ventrículos y maduran, el tejido en expansión eventualmente forma las estructuras altamente complejas del cerebro^1,2,3,4,5,6. La coordinación entre la división de los progenitores y la diferenciación y migración de las neuronas determinará el tamaño, la forma y, por tanto, la función del cerebro, afectando directamente al comportamiento^7,8,9,10. Si bien el control estricto sobre estos procesos es claramente crucial para el desarrollo normal del cerebro, los mecanismos globales que regulan estas dinámicas no se entienden bien. Aquí describimos una herramienta para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a una resolución celular, permitiendo a los investigadores visualizar las células progenitoras y las neuronas in vivo en el cerebro de pez cebra en desarrollo con Brainbow y realizar un seguimiento de su comportamiento a lo largo del tiempo a través de la microscopía confocal de lapso de tiempo¹¹. El enfoque también se puede adaptar para visualizar otras partes del embrión en desarrollo.

Para observar y distinguir entre las células en el cerebro de pez cebra en desarrollo, hemos adaptado la técnica de etiquetado celular Brainbow¹¹. Brainbow utiliza la expresión combinatoria determinada aleatoriamente de tres proteínas fluorescentes distintas (FP) para etiquetar una población de células. Mientras que la expresión predeterminada para la expresión de Brainbow es el FP rojo dTomato, la recombinación por la enzima Cre recombinase da como resultado la expresión de mCerulean (proteína fluorescente cian, CFP) o proteína fluorescente amarilla (YFP)^12,13. La cantidad combinada de cada FP expresada en una celda le da un matiz único, lo que permite una clara distinción visual de las celdas vecinas. Además, cuando una célula progenitora se divide, cada célula hija heredará el color de su célula madre, produciendo clones codificados por colores y permitiendo a los investigadores rastrear el linaje celular^11,14. Aunque originalmente se utiliza bañó para analizar circuitos neuronales en ratones^12,Brainbow se ha expresado desde entonces en una amplia variedad de organismos modelo, incluyendo el pez cebra^15.

Nuestra técnica se basa en métodos anteriores de etiquetado y imagen multicolor para crear imágenes directamente de varios clones codificados por colores a lo largo del tiempo en peces cebra vivos. Debido a su transparencia óptica como embriones, los peces cebra son muy adecuados para los experimentos de imagen^16,y estudios anteriores han utilizado Brainbow en el pez cebra para estudiar una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. La capacidad de imagen directa en el organismo vivo, junto con su rápido desarrollo ex utero, hacen del pez cebra un modelo valioso de desarrollo de vertebrados. A diferencia del cerebro de los mamíferos, toda la zona proliferativa del cerebro trasero del pez cebra está fácilmente disponible para la toma de imágenes sin interrupción de su entorno endógeno^6. Esto permite que los experimentos se lleven a cabo en el organismo vivo, en lugar de en preparaciones de tejido sin vitro o fijos. A diferencia de los experimentos de imágenes fijas, los estudios in vivo permiten un diseño longitudinal, produciendo horas de datos que se pueden analizar en busca de patrones, aumentando así la probabilidad de observar eventos relativamente raros. Dependiendo de la velocidad y la duración de los eventos de interés, los investigadores pueden optar por realizar experimentos cortos (1-2 h) o largos (hasta 16 h) de imágenes de lapso de tiempo. Mediante el uso del promotor de choque térmico de pez cebra 70 (hsp70, hsp), la expresión de Brainbow se puede controlar temporalmente^28,29. Además, la expresión de mosaico inducida por este promotor es muy adecuada para etiquetar y rastrear muchos clones^11.

La capacidad de identificar visualmente múltiples clones dentro del cerebro vivo es una ventaja de este método. Importantes estudios previos que investigaron el papel de los clones dentro del desarrollo del sistema nervioso utilizaron vectores retrovirales para etiquetar una sola célula progenitora y su progenie usando una sola FP u otra proteína fácilmente visualizada. Dicho etiquetado permite a los investigadores observar un solo clon a lo largo del tiempo, ya sea in vitro o in vivo^{2,,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. A diferencia de los métodos para rastrear el comportamiento de las células dentro de un clon, los distintos colores de Brainbow permiten a los investigadores observar la dinámica entre los clones. Además, al usar Brainbow para etiquetar muchos clones dentro del cerebro, se recopilan datos adicionales sobre el comportamiento clonal en relación con las técnicas que etiquetan un solo clon^11. Es importante destacar que los enfoques descritos aquí se pueden ampliar para generar comparaciones de desarrollo entre peces que han sufrido diferentes manipulaciones genéticas o farmacológicas¹⁸. En general, estas ventajas hacen que las imágenes confocales in vivo de barcoiris expresen el tamaño de los peces cebra sean ideales para investigadores que exploran el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, en particular aquellos interesados en el papel de los clones.