Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro^{11,2,,3,4,5,6}. A coordenação entre divisão de progenitores e diferenciação e migração de neurônios determinará o tamanho, a forma e, portanto, a função do cérebro, impactando diretamente o comportamento^7,,8,,9,,10. Embora o controle rigoroso sobre esses processos seja claramente crucial para o desenvolvimento normal do cérebro, os mecanismos globais que regulam essas dinâmicas não são bem compreendidos. Aqui descrevemos uma ferramenta para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso em uma resolução celular, permitindo que os pesquisadores visualizem células progenitoras e neurônios in vivo no cérebro de zebrafish em desenvolvimento com Brainbow e acompanhem seu comportamento ao longo do tempo através da microscopia confocal de lapso de tempo¹¹. A abordagem também pode ser adaptada para visualizar outras partes do embrião em desenvolvimento.

Para observar e distinguir entre as células no cérebro de zebrafish em desenvolvimento, adaptamos a técnica de rotulagem celular Brainbow¹¹. Brainbow utiliza a expressão combinada e determinada aleatoriamente de três proteínas fluorescentes distintas (FPs) para rotular uma população de células. Enquanto a expressão padrão para expressão Brainbow é o fp dTomato vermelho, a recombinação pela enzima Cre recombinase resulta na expressão de mCerulean (proteína fluorescente de ciano, CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP)^12,13. A quantidade combinada de cada FP expressa em uma célula lhe dá uma tonalidade única, permitindo uma clara distinção visual das células vizinhas. Além disso, quando uma célula progenitora se divide, cada célula filha herdará a cor de sua célula mãe, produzindo clones codificados por cores e permitindo que os pesquisadores rastreiem a linhagem celular^11,14. Embora originalmente usado para analisar circuitos neuronais em camundongos¹², Brainbow tem sido expresso em uma grande variedade de organismos modelo, incluindo zebrafish¹⁵.

Nossa técnica se baseia em métodos anteriores de rotulagem e imagem multicoloridas para visualizar diretamente vários clones codificados por cores ao longo do tempo em zebrafish vivos. Devido à sua transparência óptica como embriões, os zebrafish são adequados para experimentos de imagem¹⁶, e estudos anteriores têm utilizado brainbow em zebrafish para estudar uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. A capacidade de imaginar diretamente o organismo vivo, juntamente com seu rápido desenvolvimento ex-utero, fazem do zebrafish um modelo valioso de desenvolvimento de vertebrados. Em contraste com o cérebro mamífero, toda a zona proliferativa do cérebro-zebrafish está prontamente disponível para imagens sem interrupção em seu ambiente endógeno⁶. Isso permite que experimentos sejam realizados no organismo vivo, em vez de preparações de tecidos in vitro ou fixos. Em contraste com os experimentos de imagem fixa, estudos in vivo permitem um desenho longitudinal, produzindo horas de dados que podem ser analisados para padrões, aumentando assim a probabilidade de observação de eventos relativamente raros. Dependendo da velocidade e duração dos eventos de interesse, os pesquisadores podem optar por realizar experimentos de imagem curtos (1-2 h) ou longos (até ~16 h). Usando o promotor de choque térmico de zebrafish 70 (hsp70, hsp), a expressão brainbow pode ser controlada temporalmente^28,29. Além disso, a expressão de mosaico induzida por este promotor é adequada para rotular e rastrear muitos clones¹¹.

A capacidade de identificar visualmente múltiplos clones dentro do cérebro vivo é uma vantagem deste método. Importantes estudos anteriores que investigaram o papel dos clones no desenvolvimento do sistema nervoso utilizaram vetores retrovirais para rotular uma única célula progenitora e sua descendência usando um único FP ou outra proteína prontamente visualizada. Essa rotulagem permite que os pesquisadores observem um único clone ao longo do tempo, seja in vitro ou in vivo^{2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38}. Em contraste com os métodos para rastrear o comportamento das células dentro de um clone, as cores distintas do Brainbow permitem que os pesquisadores observem a dinâmica entre os clones. Além disso, usando o Brainbow para rotular muitos clones dentro do cérebro, dados adicionais sobre o comportamento clonal são coletados em relação às técnicas que rotulam um único clone¹¹. É importante ressaltar que as abordagens aqui descritas podem ser ampliadas para gerar comparações de desenvolvimento entre peixes submetidos a diferentes manipulações genéticas ou farmacológicas¹⁸. No geral, essas vantagens tornam o lapso de tempo em imagens confocais de zebrafish expressos em Brainbow ideais para pesquisadores que exploram o desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado, particularmente aqueles interessados no papel dos clones.