Summary

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Published: March 23, 2020
doi:

Summary

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Abstract

O desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado requer uma coordenação precisa de comportamentos e interações celulares complexos. O uso de técnicas de imagem in vivo de alta resolução pode fornecer uma janela clara para esses processos no organismo vivo. Por exemplo, a divisão de células e sua descendência pode ser seguida em tempo real à medida que o sistema nervoso se forma. Nos últimos anos, os avanços técnicos em técnicas multicoloridas têm ampliado os tipos de questões que podem ser investigadas. A abordagem multicolor Brainbow pode ser usada não apenas para distinguir entre células semelhantes, mas também para codificar vários clones diferentes de células relacionadas que cada um deriva de uma célula progenitora. Isso permite uma análise de linhagem multiplex de muitos clones diferentes e seus comportamentos simultaneamente durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo sarco-íris ao longo do tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento. Isso é particularmente útil para acompanhar interações celulares entre células como células, que são difíceis de rotular diferencialmente usando cores tradicionais orientadas por promotores. Nossa abordagem pode ser usada para rastrear relações de linhagem entre vários clones diferentes simultaneamente. Os grandes conjuntos de dados gerados com essa técnica fornecem informações ricas que podem ser comparadas quantitativamente entre manipulações genéticas ou farmacológicas. Em última análise, os resultados gerados podem ajudar a responder perguntas sistemáticas sobre como o sistema nervoso se desenvolve.

Introduction

Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro11,2,,3,4,5,6. A coordenação entre divisão de progenitores e diferenciação e migração de neurônios determinará o tamanho, a forma e, portanto, a função do cérebro, impactando diretamente o comportamento7,,8,,9,,10. Embora o controle rigoroso sobre esses processos seja claramente crucial para o desenvolvimento normal do cérebro, os mecanismos globais que regulam essas dinâmicas não são bem compreendidos. Aqui descrevemos uma ferramenta para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso em uma resolução celular, permitindo que os pesquisadores visualizem células progenitoras e neurônios in vivo no cérebro de zebrafish em desenvolvimento com Brainbow e acompanhem seu comportamento ao longo do tempo através da microscopia confocal de lapso de tempo11. A abordagem também pode ser adaptada para visualizar outras partes do embrião em desenvolvimento.

Para observar e distinguir entre as células no cérebro de zebrafish em desenvolvimento, adaptamos a técnica de rotulagem celular Brainbow11. Brainbow utiliza a expressão combinada e determinada aleatoriamente de três proteínas fluorescentes distintas (FPs) para rotular uma população de células. Enquanto a expressão padrão para expressão Brainbow é o fp dTomato vermelho, a recombinação pela enzima Cre recombinase resulta na expressão de mCerulean (proteína fluorescente de ciano, CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP)12,13. A quantidade combinada de cada FP expressa em uma célula lhe dá uma tonalidade única, permitindo uma clara distinção visual das células vizinhas. Além disso, quando uma célula progenitora se divide, cada célula filha herdará a cor de sua célula mãe, produzindo clones codificados por cores e permitindo que os pesquisadores rastreiem a linhagem celular11,14. Embora originalmente usado para analisar circuitos neuronais em camundongos12, Brainbow tem sido expresso em uma grande variedade de organismos modelo, incluindo zebrafish15.

Nossa técnica se baseia em métodos anteriores de rotulagem e imagem multicoloridas para visualizar diretamente vários clones codificados por cores ao longo do tempo em zebrafish vivos. Devido à sua transparência óptica como embriões, os zebrafish são adequados para experimentos de imagem16, e estudos anteriores têm utilizado brainbow em zebrafish para estudar uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. A capacidade de imaginar diretamente o organismo vivo, juntamente com seu rápido desenvolvimento ex-utero, fazem do zebrafish um modelo valioso de desenvolvimento de vertebrados. Em contraste com o cérebro mamífero, toda a zona proliferativa do cérebro-zebrafish está prontamente disponível para imagens sem interrupção em seu ambiente endógeno6. Isso permite que experimentos sejam realizados no organismo vivo, em vez de preparações de tecidos in vitro ou fixos. Em contraste com os experimentos de imagem fixa, estudos in vivo permitem um desenho longitudinal, produzindo horas de dados que podem ser analisados para padrões, aumentando assim a probabilidade de observação de eventos relativamente raros. Dependendo da velocidade e duração dos eventos de interesse, os pesquisadores podem optar por realizar experimentos de imagem curtos (1-2 h) ou longos (até ~16 h). Usando o promotor de choque térmico de zebrafish 70 (hsp70, hsp), a expressão brainbow pode ser controlada temporalmente28,29. Além disso, a expressão de mosaico induzida por este promotor é adequada para rotular e rastrear muitos clones11.

A capacidade de identificar visualmente múltiplos clones dentro do cérebro vivo é uma vantagem deste método. Importantes estudos anteriores que investigaram o papel dos clones no desenvolvimento do sistema nervoso utilizaram vetores retrovirais para rotular uma única célula progenitora e sua descendência usando um único FP ou outra proteína prontamente visualizada. Essa rotulagem permite que os pesquisadores observem um único clone ao longo do tempo, seja in vitro ou in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38. Em contraste com os métodos para rastrear o comportamento das células dentro de um clone, as cores distintas do Brainbow permitem que os pesquisadores observem a dinâmica entre os clones. Além disso, usando o Brainbow para rotular muitos clones dentro do cérebro, dados adicionais sobre o comportamento clonal são coletados em relação às técnicas que rotulam um único clone11. É importante ressaltar que as abordagens aqui descritas podem ser ampliadas para gerar comparações de desenvolvimento entre peixes submetidos a diferentes manipulações genéticas ou farmacológicas18. No geral, essas vantagens tornam o lapso de tempo em imagens confocais de zebrafish expressos em Brainbow ideais para pesquisadores que exploram o desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado, particularmente aqueles interessados no papel dos clones.

Protocol

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade Lewis & Clark. 1. Microinjeção de Embriões de Zebrafish Configurar tipo selvagem, zebrafish adulto em tanques de acasalamento segregados por sexo na tarde anterior à realização de microinjeções39,40. Prepare a solução de DNA na manhã das microinjeções. Diluir hsp:Zebr…

Representative Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a abordagem de imagem de lapso de tempo multicolor in vivo descrita aqui. Mostramos que os clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro-zebrafish em desenvolvimento14 (Figura 1). Tipicamente, quando as células rotuladas por Brainbow eram dispostas ao longo de uma fibra radial particular, elas compartilhavam a mesma co…

Discussion

Este protocolo descreve um método para visualizar clones de células progenitoras e neurônios no cérebro-zebrafish em desenvolvimento e segui-los in vivo usando Brainbow e microscopia confocal de lapso de tempo11. A principal vantagem deste protocolo em comparação com estudos in vitro ou ex vivo é a capacidade de observar diretamente a zona proliferativa do cérebro vertebrado em seu meio natural ao longo do tempo. Esta técnica baseia-se em estudos anteriores que rotularam um único clone u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet e Z. Tobias por contribuições técnicas e intelectuais. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (Prêmio 1553764) e pelo M.J. Murdock Charitable Trust.

Materials

1.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

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Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

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