Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

開発の初期段階では、特殊な前駆細胞のプールが増殖ゾーンで繰り返し分裂し、多様な娘細胞を産生する。この発達期に生まれた細胞は、分化し、新生器官を形成するために移動します。神経系では、放射状グリアなどの前駆物質は、心室領域の未熟なニューロンを生じさせる。ニューロンが心室から離れて成熟するにつれて、膨張する組織は最終的に脳^{11、2、3、4、5、62,3,4,5}の非常に複雑な構造^を6形成する。ニューロンの前駆体の分裂と分化と移動との間の調整は、脳の最終的な大きさ、形状、したがって機能を決定し、行動^{77、8、9、108,9,10}に直接影響を与える。これらのプロセスを厳しく制御することは、正常な脳の発達にとって明らかに重要ですが、これらのダイナミクスを調節するグローバルメカニズムはよく理解されていません。ここでは、細胞分解能で神経系の発達を研究するツールを説明し、研究者はBrainbowで発達中のゼブラフィッシュ脳の生体内の前駆細胞およびニューロンを視覚化し、時間経過共焦点顕微鏡¹¹を介して時間をかけてその行動を追跡することを可能にする。このアプローチは、発達中の胚の他の部分を視覚化するためにも適応することができる。

開発中のゼブラフィッシュ脳の細胞間を観察し、区別するために、我々はBrainbow細胞標識技術¹¹を適応させました。Brainbowは、3つの異なる蛍光タンパク質(FP)の無作為に決定された組み合わせ発現を利用して、細胞の集団にラベルを付けます。Brainbow発現のデフォルトの発現は赤FPdTomatoであるが、酵素Creリコンビナーゼによる再結合は、mCerulean(シアン蛍光タンパク質、CFP)または黄色蛍光タンパク質^{(YFP)12,13,13}の発現をもたらす。細胞内で表現される各FPの結合量は、それに固有の色合いを与え、隣接する細胞から明確な視覚的な区別を可能にする。さらに、前駆細胞が分裂すると、各娘細胞は母細胞から色を継承し、色分けされたクローンを産生し、研究者が細胞系^11,14,14を追跡することを可能にする。もともとマウス¹²の神経回路を解析するために使用されるが、Brainbowは、ゼブラフィッシュ¹⁵を含む多種多様なモデル生物で発現されている。

私たちの技術は、生きているゼブラフィッシュで時間の経過とともに複数の色分けされたクローンを直接画像化するための以前の多色ラベリングとイメージング方法に基づいています。胚としての光学的透明性のために、ゼブラフィッシュはイメージング実験^,16に適しており、以前の研究では、ゼブラフィッシュのBrainbowを利用して、^,神経系11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25を含む様々な組織^{18,19,20,2111,15,1723を24,25}研究してきました^{22,。2626、27。,}生物を直接画像化する能力は、彼らの急速な元子宮の開発と共に、ゼブラフィッシュを脊椎動物の発達の貴重なモデルにします。哺乳動物の脳とは対照的に、ゼブラフィッシュ後脳の増殖帯全体が、その内因性環境⁶に中断することなく画像化のために容易に利用できる。これにより、インビトロや固定組織製剤ではなく、生体内で実験を行うことができます。固定画像実験とは対照的に、in vivoの研究では縦方向の設計が可能になり、パターンについて分析できる時間のデータが生成され、比較的まれな事象を観察する可能性が高くなります。関心のある事象の速度と長さに応じて、研究者は短い(1-2時間)または長い(〜16時間まで)のタイムラプスイメージング実験を行うことを選択できます。ゼブラフィッシュヒートショックプロモーター70(hsp70,hsp)を用いることで、Brainbow発現を^28,29,29に時間的に制御することができる。さらに、このプロモーターによって誘導されるモザイク表現は、多くのクローン¹¹の標識および追跡に適している。

生きている脳内の複数のクローンを視覚的に識別する能力は、この方法の利点です。神経系の発達中のクローンの役割を調査した重要な以前の研究は、単一のFPまたは他の容易に視覚化されたタンパク質を使用して、単一の前駆細胞とその子孫を標識するためにレトロウイルスベクターを利用した。このようなラベリングは、インビトロまたはin vivo^{,,,,,,22、30、31、32、33、34、35、36、37、3830,31}のいずれかで、時間をかけて単一のクローン^3337を38観察することができます。^323435361つのクローン内の細胞の挙動を追跡する方法とは対照的に、Brainbowの異なる色は、研究者がクローン間のダイナミクスを観察することを可能にする。さらに、Brainbowを使用して脳内の多くのクローンにラベルを付け、クローンの挙動に関する追加データが、単一クローン¹¹にラベルを付ける技術に関連して収集される。重要なことに、ここで説明するアプローチは、異なる遺伝的または薬理学的操作を受けた魚間の発達的比較を生成するために拡大することができる^18。全体的に見て、これらの利点は、脊椎動物神経系の発達を探求する研究者、特にクローンの役割に興味を持つ研究者にとって理想的なBrainbow発現ゼブラフィッシュのインビボ共焦点イメージングのタイムラプスを作る。