Визуализация развивающегося мозга в жизни зебрафиш с помощью Brainbow и замедленного Confocal imaging

На ранних стадиях развития пулы специализированных клеток-прародителей делятся повторно в пролиферативных зонах, производя различные массивы дочерческих клеток. Клетки, рожденные в течение этого периода развития, затем дифференцируются и путешествуют, чтобы сформировать зарождающиеся органы. В нервной системе, прародители, такие как радиальная глия привести к незрелых нейронов в желудочковых зонах. По мере того как нейроны мигрируют от желудочков и созревают, расширяющаяся ткань в конечном итоге образует очень сложные структуры мозга^{1,,2,,33,44,6,.} Координация между декорациями и дифференциации и миграции нейронов будет определять возможный размер, форму, и, следовательно, функции мозга, непосредственно влияющих на поведение^7,8,9,10. Хотя жесткий контроль над этими процессами, безусловно, имеет решающее значение для нормального развития мозга, глобальные механизмы, которые регулируют эти динамики, не очень хорошо изучены. Здесь мы описываем инструмент для изучения развития нервной системы в клеточном разрешении, что позволяет исследователям визуализировать клетки-прародителя и нейроны in vivo в развивающемся мозге зебры с Brainbow и отслеживать их поведение с течением времени с помощью замедленной конфокальной микроскопии¹¹. Этот подход также может быть адаптирован для визуализации других частей развивающегося эмбриона.

Чтобы наблюдать и различать среди клеток в развивающемся мозге зебры, мы адаптировали метод маркировки клеток Brainbow^11. Brainbow использует случайно определенные, комбинаторные выражения трех различных флуоресцентных белков (FPs) для обозначения популяции клеток. В то время как выражение мракли иэкспрессии по умолчанию для экспрессии Brainbow является красным FP dTomato, рекомбинация фермента Cre recombinase приводит к экспрессии мцерулеана (циановый флуоресцентный белок, CFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP)^12,13. Совокупное количество каждого FP, выраженное в ячейке, придает ему уникальный оттенок, позволяющий четко ею визуальное различие с соседними клетками. Кроме того, когда клетка-прародитель делится, каждая клетка дочери унаследует цвет от своей материнской клетки, производя цветные клоны и позволяя исследователям отслеживать линию клеток^11,14. Хотя первоначально используется для анализа нейронных схем у мышей¹², Brainbow с тех пор было выражено в широком спектре типовых организмов, в том числе зебрафиш¹⁵.

Наша техника основывается на предыдущих методах многоцветной маркировки и визуализации, чтобы непосредственно изображения нескольких цветовых клонов с течением времени в живых зебры. Из-за их оптической прозрачности, как эмбрионы, зебра хорошо подходит для визуализации экспериментов¹⁶, и предыдущие исследования использовали Brainbow в зебры для изучения различных тканей, в том числе нервной системы^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. Способность непосредственно к изображению в живой организм, наряду с их быстрым развитием экс-утробы, делают зебры ценной моделью развития позвоночных. В отличие от мозга млекопитающих, вся пролиферативная зона заднего мозга зебры легко доступна для визуализации без нарушения его эндогенной среды⁶. Это позволяет проводить эксперименты в живом организме, а не в экстракорпорированных или стационарных препаратах тканей. В отличие от экспериментов с фиксированной визуализацией, исследования in vivo позволяют продольную конструкцию, производя многочасовые данные, которые могут быть проанализированы на модели, тем самым увеличивая вероятность наблюдения относительно редких событий. В зависимости от скорости и длины событий, представляющих интерес, исследователи могут выбрать для выполнения коротких (1-2 ч) или длинные (до 16 ч) эксперименты по визуализации по времени. С помощью зебры теплового шока промоутер 70 (hsp70, hsp), Brainbow выражение может быть временно контролируется^28,29. Кроме того, мозаика выражение индуцированных этот промоутер хорошо подходит для маркировки и отслеживания многих клонов¹¹.

Способность визуально идентифицировать несколько клонов в живом мозге является преимуществом этого метода. Важные предыдущие исследования, которые исследовали роль клонов в развитии нервной системы использовали ретровирусные векторы для обозначения одной клетки-прародителя и ее потомства с помощью одного FP или другого легко визуализированного белка. Такая маркировка позволяет исследователям наблюдать один клон с течением времени, либо in vitro или in vivo^{22,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38}. В отличие от методов отслеживания поведения клеток в пределах одного клона, различные цвета Brainbow позволяют исследователям наблюдать динамику среди клонов. Кроме того, с помощью Brainbow для обозначения многих клонов в головном мозге, дополнительные данные о клональном поведении собираются по отношению к методам, которые маркировать один клон¹¹. Важно отметить, что описанные здесь подходы могут быть расширены для создания сравнения развития между рыбами, которые подверглись различным генетическим или фармакологическим манипуляциям^18. В целом, эти преимущества делают промежуток времени в vivo confocal изображения Brainbow-выражения зебры идеально подходит для исследователей, исследующих развитие позвоночной нервной системы, особенно тех, кто заинтересован в роли клонов.