Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Dans les premières phases du développement, les pools de cellules progénitrices spécialisées se divisent à plusieurs reprises dans les zones de prolifération, produisant divers éventails de cellules filles. Les cellules nées au cours de cette période de développement se différencieront alors et se déplaceront pour former les organes naissants. Dans le système nerveux, les ancêtres tels que les gliales radiales donnent lieu à des neurones immatures dans les zones ventriculaires. Comme les neurones migrent loin des ventricules et mûrissent, le tissu en expansion forme finalement les structures très complexes du cerveau^1,2,3,4,5,6. La coordination entre la division des progéniteurs et la différenciation et la migration des neurones déterminera la taille, la forme et donc la fonction éventuelle du cerveau, ayant un impact direct sur le comportement^7,8,9,10. Bien qu’un contrôle serré sur ces processus soit clairement crucial pour le développement normal du cerveau, les mécanismes mondiaux qui régulent ces dynamiques ne sont pas bien compris. Ici, nous décrivons un outil pour étudier le développement du système nerveux à une résolution cellulaire, permettant aux chercheurs de visualiser les cellules progénitrices et les neurones in vivo dans le cerveau du poisson zèbre en développement avec Brainbow et suivre leur comportement au fil du temps via la microscopie confocale en time-lapse¹¹. L’approche peut également être adaptée pour visualiser d’autres parties de l’embryon en développement.

Pour observer et distinguer entre les cellules du cerveau du poisson zèbre en développement, nous avons adapté la technique d’étiquetage cellulaire Brainbow¹¹. Brainbow utilise l’expression combinatoire déterminée au hasard de trois protéines fluorescentes distinctes (FPs) pour étiqueter une population de cellules. Tandis que l’expression par défaut pour l’expression de Brainbow est le dTomato rouge de FP, la recombinaination par l’enzyme Cre recombinase résulte dans l’expression du mcerulean (protéine fluorescente cyane, CFP) ou protéine fluorescente jaune (YFP)^12,13. La quantité combinée de chaque FP exprimée dans une cellule lui donne une teinte unique, permettant une distinction visuelle claire des cellules voisines. En outre, quand une cellule progénitrice se divise, chaque cellule de fille héritera de la couleur de sa cellule mère, produisant des clones à code couleur et permettant aux chercheurs de tracer la lignée cellulaire^11,14. Bien qu’à l’origine utilisé pour analyser les circuits neuronaux chez la souris¹², Brainbow a depuis été exprimé dans une grande variété d’organismes modèles, y compris le poisson zèbre¹⁵.

Notre technique s’appuie sur les méthodes précédentes d’étiquetage et d’imagerie multicolores pour imager directement plusieurs clones à code couleur au fil du temps dans les poissons zèbres vivants. En raison de leur transparence optique en tant qu’embryons, le poisson zèbre sont bien adaptés aux expériences d’imagerie¹⁶, et des études précédentes ont utilisé Brainbow dans le poisson zèbre pour étudier une variété de tissus, y compris le système nerveux^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. La capacité d’imager directement dans l’organisme vivant, avec leur développement ex-utérus rapide, font du poisson zèbre un modèle précieux de développement des vertébrés. Contrairement au cerveau des mammifères, toute la zone de prolifération du cerveau postérieur du poisson zèbre est facilement disponible pour l’imagerie sans perturber son environnement endogène⁶. Cela permet de mener des expériences dans l’organisme vivant, plutôt que dans les préparations de tissus in vitro ou fixes. Contrairement aux expériences d’imagerie fixe, les études in vivo permettent une conception longitudinale, produisant des heures de données qui peuvent être analysées pour les modèles, augmentant ainsi la probabilité d’observer des événements relativement rares. Selon la vitesse et la durée des événements d’intérêt, les chercheurs peuvent choisir d’effectuer des expériences d’imagerie courte (1 à 2 h) ou longues (jusqu’à 16 h). En utilisant le promoteur de choc thermique du poisson zèbre 70 (hsp70, hsp), l’expression Brainbow peut être contrôlé temporellement^28,29. En outre, l’expression mosaïque induite par ce promoteur est bien adaptée à l’étiquetage et le suivi de nombreux clones¹¹.

La capacité d’identifier visuellement plusieurs clones dans le cerveau vivant est un avantage de cette méthode. D’importantes études antérieures qui ont étudié le rôle des clones dans le développement du système nerveux ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour étiqueter une seule cellule progénitrice et sa progéniture à l’aide d’un seul FP ou d’une autre protéine facilement visualisée. Un tel étiquetage permet aux chercheurs d’observer un seul clone au fil du temps, in vitro ou in vivo^{2,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. Contrairement aux méthodes de suivi du comportement des cellules au sein d’un clone, les couleurs distinctes de Brainbow permettent aux chercheurs d’observer la dynamique parmi les clones. En outre, en utilisant Brainbow pour étiqueter de nombreux clones dans le cerveau, des données supplémentaires sur le comportement clonal sont recueillies par rapport aux techniques qui étiquetent un seul clone¹¹. Fait important, les approches décrites ici peuvent être élargies pour générer des comparaisons de développement entre les poissons qui ont subi différentes manipulations génétiques ou pharmacologiques¹⁸. Dans l’ensemble, ces avantages rendent l’imagerie confocale en vivo du poisson zèbre Brainbow-exprimant idéal pour les chercheurs explorant le développement du système nerveux vertébré, en particulier ceux qui s’intéressent au rôle des clones.