Summary

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Published: March 23, 2020
doi:

Summary

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Abstract

Le développement du système nerveux vertébré nécessite une coordination précise des comportements cellulaires complexes et des interactions. L’utilisation de techniques d’imagerie in vivo à haute résolution peut fournir une fenêtre claire sur ces processus dans l’organisme vivant. Par exemple, la division des cellules et de leur progéniture peut être suivie en temps réel au fur et à mesure que le système nerveux se forme. Ces dernières années, les progrès techniques dans les techniques multicolores ont élargi les types de questions qui peuvent être étudiées. L’approche multicolore Brainbow peut être utilisée non seulement pour distinguer entre les cellules comme, mais aussi pour code couleur plusieurs clones différents de cellules connexes que chacun dérive d’une cellule progénitrice. Cela permet une analyse de lignée multiplexe de nombreux clones différents et leurs comportements simultanément pendant le développement. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow sur le temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement. Ceci est particulièrement utile pour suivre les interactions cellulaires entre les cellules comme, qui sont difficiles à étiqueter différentiellement en utilisant des couleurs traditionnelles axées sur les promoteurs. Notre approche peut être utilisée pour suivre les relations de lignée entre plusieurs clones différents simultanément. Les grands ensembles de données générés à l’aide de cette technique fournissent des informations riches qui peuvent être comparées quantitativement à travers les manipulations génétiques ou pharmacologiques. En fin de compte, les résultats générés peuvent aider à répondre à des questions systématiques sur la façon dont le système nerveux se développe.

Introduction

Dans les premières phases du développement, les pools de cellules progénitrices spécialisées se divisent à plusieurs reprises dans les zones de prolifération, produisant divers éventails de cellules filles. Les cellules nées au cours de cette période de développement se différencieront alors et se déplaceront pour former les organes naissants. Dans le système nerveux, les ancêtres tels que les gliales radiales donnent lieu à des neurones immatures dans les zones ventriculaires. Comme les neurones migrent loin des ventricules et mûrissent, le tissu en expansion forme finalement les structures très complexes du cerveau1,2,3,4,5,6. La coordination entre la division des progéniteurs et la différenciation et la migration des neurones déterminera la taille, la forme et donc la fonction éventuelle du cerveau, ayant un impact direct sur le comportement7,8,9,10. Bien qu’un contrôle serré sur ces processus soit clairement crucial pour le développement normal du cerveau, les mécanismes mondiaux qui régulent ces dynamiques ne sont pas bien compris. Ici, nous décrivons un outil pour étudier le développement du système nerveux à une résolution cellulaire, permettant aux chercheurs de visualiser les cellules progénitrices et les neurones in vivo dans le cerveau du poisson zèbre en développement avec Brainbow et suivre leur comportement au fil du temps via la microscopie confocale en time-lapse11. L’approche peut également être adaptée pour visualiser d’autres parties de l’embryon en développement.

Pour observer et distinguer entre les cellules du cerveau du poisson zèbre en développement, nous avons adapté la technique d’étiquetage cellulaire Brainbow11. Brainbow utilise l’expression combinatoire déterminée au hasard de trois protéines fluorescentes distinctes (FPs) pour étiqueter une population de cellules. Tandis que l’expression par défaut pour l’expression de Brainbow est le dTomato rouge de FP, la recombinaination par l’enzyme Cre recombinase résulte dans l’expression du mcerulean (protéine fluorescente cyane, CFP) ou protéine fluorescente jaune (YFP)12,13. La quantité combinée de chaque FP exprimée dans une cellule lui donne une teinte unique, permettant une distinction visuelle claire des cellules voisines. En outre, quand une cellule progénitrice se divise, chaque cellule de fille héritera de la couleur de sa cellule mère, produisant des clones à code couleur et permettant aux chercheurs de tracer la lignée cellulaire11,14. Bien qu’à l’origine utilisé pour analyser les circuits neuronaux chez la souris12, Brainbow a depuis été exprimé dans une grande variété d’organismes modèles, y compris le poisson zèbre15.

Notre technique s’appuie sur les méthodes précédentes d’étiquetage et d’imagerie multicolores pour imager directement plusieurs clones à code couleur au fil du temps dans les poissons zèbres vivants. En raison de leur transparence optique en tant qu’embryons, le poisson zèbre sont bien adaptés aux expériences d’imagerie16, et des études précédentes ont utilisé Brainbow dans le poisson zèbre pour étudier une variété de tissus, y compris le système nerveux11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacité d’imager directement dans l’organisme vivant, avec leur développement ex-utérus rapide, font du poisson zèbre un modèle précieux de développement des vertébrés. Contrairement au cerveau des mammifères, toute la zone de prolifération du cerveau postérieur du poisson zèbre est facilement disponible pour l’imagerie sans perturber son environnement endogène6. Cela permet de mener des expériences dans l’organisme vivant, plutôt que dans les préparations de tissus in vitro ou fixes. Contrairement aux expériences d’imagerie fixe, les études in vivo permettent une conception longitudinale, produisant des heures de données qui peuvent être analysées pour les modèles, augmentant ainsi la probabilité d’observer des événements relativement rares. Selon la vitesse et la durée des événements d’intérêt, les chercheurs peuvent choisir d’effectuer des expériences d’imagerie courte (1 à 2 h) ou longues (jusqu’à 16 h). En utilisant le promoteur de choc thermique du poisson zèbre 70 (hsp70, hsp), l’expression Brainbow peut être contrôlé temporellement28,29. En outre, l’expression mosaïque induite par ce promoteur est bien adaptée à l’étiquetage et le suivi de nombreux clones11.

La capacité d’identifier visuellement plusieurs clones dans le cerveau vivant est un avantage de cette méthode. D’importantes études antérieures qui ont étudié le rôle des clones dans le développement du système nerveux ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour étiqueter une seule cellule progénitrice et sa progéniture à l’aide d’un seul FP ou d’une autre protéine facilement visualisée. Un tel étiquetage permet aux chercheurs d’observer un seul clone au fil du temps, in vitro ou in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Contrairement aux méthodes de suivi du comportement des cellules au sein d’un clone, les couleurs distinctes de Brainbow permettent aux chercheurs d’observer la dynamique parmi les clones. En outre, en utilisant Brainbow pour étiqueter de nombreux clones dans le cerveau, des données supplémentaires sur le comportement clonal sont recueillies par rapport aux techniques qui étiquetent un seul clone11. Fait important, les approches décrites ici peuvent être élargies pour générer des comparaisons de développement entre les poissons qui ont subi différentes manipulations génétiques ou pharmacologiques18. Dans l’ensemble, ces avantages rendent l’imagerie confocale en vivo du poisson zèbre Brainbow-exprimant idéal pour les chercheurs explorant le développement du système nerveux vertébré, en particulier ceux qui s’intéressent au rôle des clones.

Protocol

Les procédures relatives aux sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Lewis and Clark College. 1. Microinjection d’embryons de poissons zèbres Installez le type sauvage, le poisson zèbre adulte dans les cuves d’accouplement sex-ségréguées l’après-midi avant d’effectuer des microinjections39,40. Préparer la solution d’ADN l…

Representative Results

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide de l’approche d’imagerie multicolore in vivo décrite ici. Nous montrons que Brainbow clones codés en couleur de cellules dans la zone ventriculaire proliférée de l’arrière-poisson zèbre en développement14 (figure 1). Typiquement, lorsque les cellules étiquetées Brainbow ont été disposées le long d’une fibre radiale particulière, elle…

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser les clones de cellules progénitrices et de neurones dans le cerveau postérieur du poisson zèbre en développement et les suivre in vivo à l’aide de Brainbow et de microscopie confocale en time-lapse11. Le principal avantage de ce protocole par rapport aux études in vitro ou ex vivo est la capacité d’observer directement la zone de prolifération du cerveau vertébré dans son milieu naturel au fil du temps. Cette technique s’appuie sur …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Y. A. Pan, J. Livet et Z. Tobias pour leurs contributions techniques et intellectuelles. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Award 1553764) et le M.J. Murdock Charitable Trust.

Materials

1.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

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Cite This Article
Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

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