In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.
Ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel vereist een nauwkeurige coördinatie van complex cellulair gedrag en interacties. Het gebruik van hoge resolutie in vivo beeldvormingstechnieken kan een duidelijk venster geven op deze processen in het levende organisme. Bijvoorbeeld, delen cellen en hun nakomelingen kan worden gevolgd in real time als het zenuwstelsel vormen. In de afgelopen jaren hebben de technische ontwikkelingen in veelkleurige technieken de soorten vragen die kunnen worden onderzocht, uitgebreid. De multicolor Brainbow aanpak kan worden gebruikt om niet alleen onderscheid te maken tussen zoals cellen, maar ook om kleur-code meerdere verschillende klonen van verwante cellen die elk afkomstig zijn uit een voorloper cel. Dit zorgt voor een multiplex lineage analyse van veel verschillende klonen en hun gedrag tegelijkertijd tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen te visualiseren over real-time binnen het zich ontwikkelende zebravis zenuwstelsel. Dit is vooral handig voor het volgen van cellulaire interacties tussen dergelijke cellen, die moeilijk differentieel te labelen met behulp van traditionele promotor-gedreven kleuren. Onze aanpak kan worden gebruikt voor het bijhouden van afstammingsrelaties tussen meerdere verschillende klonen tegelijk. De grote datasets gegenereerd met behulp van deze techniek bieden rijke informatie die kwantitatief kan worden vergeleken met genetische of farmacologische manipulaties. Uiteindelijk kunnen de gegenereerde resultaten helpen om systematische vragen te beantwoorden over hoe het zenuwstelsel zich ontwikkelt.
In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen1,2,3,4,5,6. De coördinatie tussen de verdeling van de voorouders en differentiatie en migratie van neuronen zal de uiteindelijke grootte, vorm en dus functie van de hersenen bepalen, die direct gedragbeïnvloeden 7,8,9,10. Hoewel strakke controle over deze processen duidelijk cruciaal is voor de normale ontwikkeling van de hersenen, zijn de globale mechanismen die deze dynamiek reguleren niet goed begrepen. Hier beschrijven we een hulpmiddel om de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen met een cellulaire resolutie, waardoor onderzoekers voorlopercellen en neuronen in vivo in het zich ontwikkelende zebravisbrein met Brainbow kunnen visualiseren en hun gedrag in de loop van de tijd kunnen volgen via time-lapse confocale microscopie11. De aanpak kan ook worden aangepast om andere delen van het zich ontwikkelende embryo te visualiseren.
Om cellen in het zich ontwikkelende zebravisbrein te observeren en te onderscheiden, hebben we de Brainbow cellabelingtechniek11aangepast. Brainbow maakt gebruik van de willekeurig bepaalde, combinatorische expressie van drie verschillende fluorescerende eiwitten (FPs) om een populatie van cellen te labelen. Terwijl de standaardexpressie voor Brainbow-expressie de rode FP dTomato is, resulteert recombinatie door het enzym Cre recombinase in expressie van mCerulean (cyaan fluorescerend eiwit, GVB) of geel fluorescerend eiwit (YFP)12,13. De gecombineerde hoeveelheid van elke FP uitgedrukt in een cel geeft het een unieke tint, waardoor duidelijk visueel onderscheid van naburige cellen. Bovendien, wanneer een voorloper cel verdeelt, zal elke dochtercel erven de kleur van zijn moedercel, producerenkleurgecodeerde klonen en waardoor onderzoekers celafstamming11,,14traceren . Terwijl oorspronkelijk gebruikt om neuronale circuits bij muizen12te analyseren, is Brainbow sindsdien uitgedrukt in een breed scala van modelorganismen, waaronder zebravis15.
Onze techniek bouwt voort op eerdere multicolor labeling en imaging methoden om direct beeld meerdere kleurgecodeerde klonen na verloop van tijd in levende zebravissen. Vanwege hun optische transparantie als embryo’s, zebravissen zijn zeer geschikt voor beeldvorming experimenten16, en eerdere studies hebben brainbow gebruikt in zebravissen om een verscheidenheid van weefsels te bestuderen, met inbegrip van het zenuwstelsel11,15,17,19,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. De mogelijkheid om direct beeld in het levende organisme, samen met hun snelle ex-utero ontwikkeling, maken zebravissen een waardevol model van gewervelde ontwikkeling. In tegenstelling tot de zoogdierhersenen is de gehele proliferative zone van de zebravisachterbrein direct beschikbaar voor beeldvorming zonder verstoring van zijn endogene omgeving6. Hierdoor kunnen experimenten worden uitgevoerd in het levende organisme, in plaats van in vitro of vaste weefselpreparaten. In tegenstelling tot vaste beeldvormingsexperimenten maken in vivo studies een longitudinale ontwerp mogelijk, waardoor uren aan gegevens worden geproduceerd die kunnen worden geanalyseerd op patronen, waardoor de kans op het waarnemen van relatief zeldzame gebeurtenissen toeneemt. Afhankelijk van de snelheid en lengte van de gebeurtenissen van belang, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om korte (1-2 uur) of lange (tot ~ 16 uur) time-lapse imaging experimenten uit te voeren. Door het gebruik van de zebrafish heat shock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow expressie kan tijdelijk worden gecontroleerd28,29. Bovendien, de mozaïek uitdrukking geïnduceerd door deze promotor is zeer geschikt voor etikettering en het bijhouden van vele klonen11.
De mogelijkheid om visueel te identificeren meerdere klonen in de levende hersenen is een voordeel van deze methode. Belangrijke eerdere studies die de rol van klonen binnen de ontwikkeling van het zenuwstelsel onderzocht gebruikt retrovirale vectoren om een enkele voorloper cel en zijn nakomelingen label met behulp van een enkele FP of andere gemakkelijk gevisualiseerde eiwitten. Een dergelijke etikettering stelt onderzoekers in staat om in de loop van de tijd één kloon te observeren, hetzij in vitro , hetzij in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In tegenstelling tot methoden om het gedrag van cellen in één kloon te volgen, stellen de verschillende kleuren van Brainbow onderzoekers in staat om dynamiek onder klonen te observeren. Bovendien, door brainbow te gebruiken om vele klonen binnen de hersenen te etiketteren, worden de extra gegevens over clonal gedrag verzameld met betrekking tot technieken die één enkele kloonetiket1. Belangrijk is dat de hier beschreven benaderingen kunnen worden uitgebreid om ontwikkelingsvergelijkingen te genereren tussen vissen die verschillende genetische of farmacologische manipulaties hebben ondergaan18. Over het algemeen maken deze voordelen time-lapse in vivo confocale beeldvorming van Brainbow-uitdrukkende zebravissen ideaal voor onderzoekers die de ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel onderzoeken, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in de rol van klonen.
Dit protocol beschrijft een methode om klonen van voorlopercellen en neuronen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersens te visualiseren en ze in vivo te volgen met behulp van Brainbow en time-lapse confocale microscopie11. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met in vitro of ex vivo studies is de mogelijkheid om de proliferative zone van de gewervelde hersenen in zijn natuurlijke omgeving in de loop van de tijd direct te observeren. Deze techniek bouwt voort op eerdere studies…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Y. A. Pan, J. Livet en Z. Tobias voor technische en intellectuele bijdragen. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Award 1553764) en de M.J. Murdock Charitable Trust.
1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
Epifluorescence dissection scope | |||
Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
Phenol red | Sigma | P0290 | |
Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |