Summary

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Published: March 23, 2020
doi:

Summary

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Abstract

Ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel vereist een nauwkeurige coördinatie van complex cellulair gedrag en interacties. Het gebruik van hoge resolutie in vivo beeldvormingstechnieken kan een duidelijk venster geven op deze processen in het levende organisme. Bijvoorbeeld, delen cellen en hun nakomelingen kan worden gevolgd in real time als het zenuwstelsel vormen. In de afgelopen jaren hebben de technische ontwikkelingen in veelkleurige technieken de soorten vragen die kunnen worden onderzocht, uitgebreid. De multicolor Brainbow aanpak kan worden gebruikt om niet alleen onderscheid te maken tussen zoals cellen, maar ook om kleur-code meerdere verschillende klonen van verwante cellen die elk afkomstig zijn uit een voorloper cel. Dit zorgt voor een multiplex lineage analyse van veel verschillende klonen en hun gedrag tegelijkertijd tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen te visualiseren over real-time binnen het zich ontwikkelende zebravis zenuwstelsel. Dit is vooral handig voor het volgen van cellulaire interacties tussen dergelijke cellen, die moeilijk differentieel te labelen met behulp van traditionele promotor-gedreven kleuren. Onze aanpak kan worden gebruikt voor het bijhouden van afstammingsrelaties tussen meerdere verschillende klonen tegelijk. De grote datasets gegenereerd met behulp van deze techniek bieden rijke informatie die kwantitatief kan worden vergeleken met genetische of farmacologische manipulaties. Uiteindelijk kunnen de gegenereerde resultaten helpen om systematische vragen te beantwoorden over hoe het zenuwstelsel zich ontwikkelt.

Introduction

In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen1,2,3,4,5,6. De coördinatie tussen de verdeling van de voorouders en differentiatie en migratie van neuronen zal de uiteindelijke grootte, vorm en dus functie van de hersenen bepalen, die direct gedragbeïnvloeden 7,8,9,10. Hoewel strakke controle over deze processen duidelijk cruciaal is voor de normale ontwikkeling van de hersenen, zijn de globale mechanismen die deze dynamiek reguleren niet goed begrepen. Hier beschrijven we een hulpmiddel om de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen met een cellulaire resolutie, waardoor onderzoekers voorlopercellen en neuronen in vivo in het zich ontwikkelende zebravisbrein met Brainbow kunnen visualiseren en hun gedrag in de loop van de tijd kunnen volgen via time-lapse confocale microscopie11. De aanpak kan ook worden aangepast om andere delen van het zich ontwikkelende embryo te visualiseren.

Om cellen in het zich ontwikkelende zebravisbrein te observeren en te onderscheiden, hebben we de Brainbow cellabelingtechniek11aangepast. Brainbow maakt gebruik van de willekeurig bepaalde, combinatorische expressie van drie verschillende fluorescerende eiwitten (FPs) om een populatie van cellen te labelen. Terwijl de standaardexpressie voor Brainbow-expressie de rode FP dTomato is, resulteert recombinatie door het enzym Cre recombinase in expressie van mCerulean (cyaan fluorescerend eiwit, GVB) of geel fluorescerend eiwit (YFP)12,13. De gecombineerde hoeveelheid van elke FP uitgedrukt in een cel geeft het een unieke tint, waardoor duidelijk visueel onderscheid van naburige cellen. Bovendien, wanneer een voorloper cel verdeelt, zal elke dochtercel erven de kleur van zijn moedercel, producerenkleurgecodeerde klonen en waardoor onderzoekers celafstamming11,,14traceren . Terwijl oorspronkelijk gebruikt om neuronale circuits bij muizen12te analyseren, is Brainbow sindsdien uitgedrukt in een breed scala van modelorganismen, waaronder zebravis15.

Onze techniek bouwt voort op eerdere multicolor labeling en imaging methoden om direct beeld meerdere kleurgecodeerde klonen na verloop van tijd in levende zebravissen. Vanwege hun optische transparantie als embryo’s, zebravissen zijn zeer geschikt voor beeldvorming experimenten16, en eerdere studies hebben brainbow gebruikt in zebravissen om een verscheidenheid van weefsels te bestuderen, met inbegrip van het zenuwstelsel11,15,17,19,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. De mogelijkheid om direct beeld in het levende organisme, samen met hun snelle ex-utero ontwikkeling, maken zebravissen een waardevol model van gewervelde ontwikkeling. In tegenstelling tot de zoogdierhersenen is de gehele proliferative zone van de zebravisachterbrein direct beschikbaar voor beeldvorming zonder verstoring van zijn endogene omgeving6. Hierdoor kunnen experimenten worden uitgevoerd in het levende organisme, in plaats van in vitro of vaste weefselpreparaten. In tegenstelling tot vaste beeldvormingsexperimenten maken in vivo studies een longitudinale ontwerp mogelijk, waardoor uren aan gegevens worden geproduceerd die kunnen worden geanalyseerd op patronen, waardoor de kans op het waarnemen van relatief zeldzame gebeurtenissen toeneemt. Afhankelijk van de snelheid en lengte van de gebeurtenissen van belang, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om korte (1-2 uur) of lange (tot ~ 16 uur) time-lapse imaging experimenten uit te voeren. Door het gebruik van de zebrafish heat shock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow expressie kan tijdelijk worden gecontroleerd28,29. Bovendien, de mozaïek uitdrukking geïnduceerd door deze promotor is zeer geschikt voor etikettering en het bijhouden van vele klonen11.

De mogelijkheid om visueel te identificeren meerdere klonen in de levende hersenen is een voordeel van deze methode. Belangrijke eerdere studies die de rol van klonen binnen de ontwikkeling van het zenuwstelsel onderzocht gebruikt retrovirale vectoren om een enkele voorloper cel en zijn nakomelingen label met behulp van een enkele FP of andere gemakkelijk gevisualiseerde eiwitten. Een dergelijke etikettering stelt onderzoekers in staat om in de loop van de tijd één kloon te observeren, hetzij in vitro , hetzij in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In tegenstelling tot methoden om het gedrag van cellen in één kloon te volgen, stellen de verschillende kleuren van Brainbow onderzoekers in staat om dynamiek onder klonen te observeren. Bovendien, door brainbow te gebruiken om vele klonen binnen de hersenen te etiketteren, worden de extra gegevens over clonal gedrag verzameld met betrekking tot technieken die één enkele kloonetiket1. Belangrijk is dat de hier beschreven benaderingen kunnen worden uitgebreid om ontwikkelingsvergelijkingen te genereren tussen vissen die verschillende genetische of farmacologische manipulaties hebben ondergaan18. Over het algemeen maken deze voordelen time-lapse in vivo confocale beeldvorming van Brainbow-uitdrukkende zebravissen ideaal voor onderzoekers die de ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel onderzoeken, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in de rol van klonen.

Protocol

Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Het Lewis & Clark College. 1. Micro-injectie van zebravisembryo’s Zet wilde type, volwassen zebravissen in geslacht gescheiden paring tanks de middag voorafgaand aan het uitvoeren van micro-injecties39,40. Bereid de DNA-oplossing voor in de ochtend van de micro-injecties. Verdun hsp:Zebrabow</em…

Representative Results

Deze sectie illustreert voorbeelden van resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de in vivo multicolor time-lapse imaging aanpak die hier wordt beschreven. We tonen aan dat Brainbow kleurgecodeerde klonen van cellen in de proliferative venricular zone van de zich ontwikkelende zebravis achterhersenhelft14 (Figuur 1). Typisch, toen Brainbow-gelabelde cellen werden gerangschikt langs een bepaalde radiale vezel, ze deelden dezelfd…

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode om klonen van voorlopercellen en neuronen in de zich ontwikkelende zebravis achterhersens te visualiseren en ze in vivo te volgen met behulp van Brainbow en time-lapse confocale microscopie11. Het grote voordeel van dit protocol in vergelijking met in vitro of ex vivo studies is de mogelijkheid om de proliferative zone van de gewervelde hersenen in zijn natuurlijke omgeving in de loop van de tijd direct te observeren. Deze techniek bouwt voort op eerdere studies…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Y. A. Pan, J. Livet en Z. Tobias voor technische en intellectuele bijdragen. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (Award 1553764) en de M.J. Murdock Charitable Trust.

Materials

1.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Play Video

Cite This Article
Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

View Video