Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

In den frühen Entwicklungsphasen teilen sich Pools spezialisierter Vorläuferzellen wiederholt in proliferativeZonen und produzieren verschiedene Arrays von Tochterzellen. Die Zellen, die während dieser Entwicklungsperiode geboren werden, werden sich dann differenzieren und reisen, um die entstehenden Organe zu bilden. Im Nervensystem führen Vorläufer wie radiale Glia zu unreifen Neuronen in ventrikulären Zonen. Wenn Neuronen von Ventrikeln wegwandern und reifen, bildet das expandierende Gewebe schließlich die hochkomplexen Strukturen des Gehirns^1,2,3,4,5,6. Die Koordination zwischen Derliganundierung und Differenzierung und Migration von Neuronen wird die endgültige Größe, Form und damit Funktion des Gehirns bestimmen, direkt beeinflussenverhalten^7,8,9,10. Während eine strenge Kontrolle über diese Prozesse eindeutig entscheidend für die normale Gehirnentwicklung ist, sind die globalen Mechanismen, die diese Dynamik regulieren, nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir ein Werkzeug, um die Entwicklung des Nervensystems mit einer zellulären Auflösung zu untersuchen, so dass Forscher Progenitorzellen und Neuronen in vivo im sich entwickelnden Zebrafischhirn mit Brainbow visualisieren und ihr Verhalten im Laufe der Zeit über die Zeitraffer-Konfokalmikroskopie¹¹verfolgen können. Der Ansatz kann auch angepasst werden, um andere Teile des sich entwickelnden Embryos zu visualisieren.

Um zellenimimim entwickelnden Zebrafischhirn zu beobachten und zu unterscheiden, haben wir die Brainbow-Zellbeschriftungstechnik¹¹angepasst. Brainbow verwendet die zufällig ermittelte, kombinatorische Expression von drei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (FPs), um eine Population von Zellen zu kennzeichnen. Während die Standardexpression für brainbow Expression die rote FP dTomato ist, führt die Rekombination durch das Enzym Cre recombinase zur Expression von mCerulean (Cyan fluoreszierendes Protein, CFP) oder gelbem fluoreszierendem Protein (YFP)^12,13. Die kombinierte Menge jedes FP, die in einer Zelle ausgedrückt wird, verleiht ihm einen einzigartigen Farbton, der eine klare visuelle Unterscheidung von benachbarten Zellen ermöglicht. Wenn sich eine Vorläuferzelle teilt, erbt jede Tochterzelle die Farbe von ihrer Mutterzelle, erzeugt farbcodierte Klone und ermöglicht es Forschern, die Zelllinie^11,14nachzuverfolgen. Während ursprünglich verwendet, um neuronale Schaltkreise bei Mäusen¹²zu analysieren, Brainbow wurde seitdem in einer Vielzahl von Modellorganismen exprimiert, einschließlich Zebrafisch¹⁵.

Unsere Technik baut auf früheren mehrfarbigen Etikettierungs- und Bildgebungsmethoden auf, um mehrere farbcodierte Klone im Laufe der Zeit direkt in lebenden Zebrafischen abzubilden. Aufgrund ihrer optischen Transparenz als Embryonen eignen sich Zebrafische gut für bildgebende Experimente¹⁶, und frühere Studien haben Brainbow in Zebrafischen verwendet, um eine Vielzahl von Geweben zu studieren, einschließlich des Nervensystems^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. Die Fähigkeit, sich direkt in den lebenden Organismus einbilden zu können, zusammen mit ihrer schnellen Ex-Utero-Entwicklung, machen Zebrafische zu einem wertvollen Modell der Wirbeltierentwicklung. Im Gegensatz zum Säugetierhirn ist die gesamte proliferative Zone des Zebrafisch-Hinterhirns leicht für die Bildgebung ohne Störung seiner endogene^Umgebung6 verfügbar. Dies ermöglicht Experimente im lebenden Organismus, anstatt in vitro oder festen Gewebepräparaten. Im Gegensatz zu festen bildgebenden Experimenten ermöglichen In-vivo-Studien ein Längsdesign, das stundenlange Datenergebnisse erzeugt, die auf Muster analysiert werden können, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, relativ seltene Ereignisse zu beobachten. Je nach Geschwindigkeit und Länge der Ereignisse von Interesse können die Forscher kurze (1-2 h) oder lange (bis zu 16 h) Zeitraffer-Bildgebungsexperimente durchführen. Durch die Verwendung des Zebrafisch-Wärmeschockpromotors 70 (hsp70, hsp) kann der Brainbow-Ausdruck zeitlich gesteuert werden^28,29. Darüber hinaus eignet sich der von diesem Promotor induzierte Mosaikausdruck gut zum Etikettieren und Verfolgen vieler Klone¹¹.

Die Fähigkeit, mehrere Klone im lebenden Gehirn visuell zu identifizieren, ist ein Vorteil dieser Methode. Wichtige frühere Studien, die die Rolle von Klonen in der Entwicklung des Nervensystems untersuchten, nutzten retrovirale Vektoren, um eine einzelne Vorläuferzelle und ihre Nachkommen mit einem einzigen FP oder einem anderen leicht visualisierten Protein zu kennzeichnen. Eine solche Kennzeichnung ermöglicht es Forschern, einen einzelnen Klon im Laufe der Zeit zu beobachten, entweder in vitro oder in vivo^{2,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. Im Gegensatz zu Methoden, um das Verhalten von Zellen innerhalb eines Klons zu verfolgen, ermöglichen die unterschiedlichen Farben von Brainbow forschern, die Dynamik zwischen Klonen zu beobachten. Darüber hinaus werden durch die Verwendung von Brainbow, um viele Klone im Gehirn zu kennzeichnen, zusätzliche Daten über das klonale Verhalten im Verhältnis zu Techniken gesammelt, die einen einzelnen Klon¹¹kennzeichnen. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Ansätze erweitert werden können, um Entwicklungsvergleiche zwischen Fischen zu erzeugen, die unterschiedliche genetischen oder pharmakologischen Manipulationen unterzogen wurden¹⁸. Insgesamt machen diese Vorteile die Zeitraffer-in-vivo-Konfokalbildgebung von Brainbow-exprimierenden Zebrafischen ideal für Forscher, die die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erforschen, insbesondere für diejenigen, die an der Rolle von Klonen interessiert sind.