Purkinje Sobrevivência celular em culturas organotípicas cerebelares fatia

A modelagem in vitro é uma ferramenta essencial na pesquisa biomédica. Ele permite que os investigadores para estudar e controlar rigorosamente mecanismos específicos em tipos de células restritas, ou em sistemas isolados / órgãos. A cultura organotípica da fatia é uma técnica in vitro amplamente utilizada, especial no campo da neurociência^1. O método foi estabelecido pela primeira vez por Gähwiler, que cultou fatias cerebrais usando a técnica de tubo de rolo^2,e mais tarde modificado por Yamamoto et al., que introduziu o uso de uma membrana microporosa para realizar culturas de fatias corticais³. Em comparação com as culturas celulares primárias, as culturas organotípicas apresentam a vantagem de preservar a citoarquitetura do tecido, bem como as conexões células-células nativas no plano da seção de tecido.

As fatias organotípicas foram cultivadas a partir de muitas partes do sistema nervoso central, como o hipocampo^4,córtex^5,estriado^6,cerebelo^4,7,e medula espinhal^8,9,entre outros. Eles foram provados para ser uma ferramenta poderosa na descoberta de drogas estudos¹⁰. Os efeitos das moléculas neuroativas podem ser avaliados de muitas maneiras: sobrevivência e neurodegeneração usando imunomanchas e bioquímica, formação de circuito neuronal ou interrupção usando eletrofisiologia e imagem viva.

O objetivo deste trabalho é descrever um método simples para realizar a cultura cerebellar organotypic da fatia, que é sabida para ser um modelo relevante para imitar o desenvolvimento cerebellar in vitro. Particularmente, nós focalizamos no estudo da morte desenvolvente da pilha de Purkinje. In vivo, as células de Purkinje passam por apoptose durante a primeira semana pós-natal, atingindo o pico no dia pós-natal 3 (P3)¹¹. O mesmo padrão é observado na cultura cerebellar fatia, com neurônios Purkinje morrendo por apoptose quando cerebella são retirados de animais entre P1 e P8, com um pico de P3^4,12. O uso das culturas organotípicas de fatiacerebelares permitiu identificar várias moléculas neuroprotetoras^7,13,bem como compreender parte dos mecanismos envolvidos nesta morte celular programada^14,15,16. Aqui, descrevemos um protocolo baseado no estudo de Stoppini et al.¹⁷ no hipocampo, e adaptado ao cerebelo por Dusart et al.⁴ Inclui dissecação rápida e corte de cerebella pós-natal; cortar a cultura em uma inserção da cultura celular contendo uma membrana microporosa, com ou sem tratamento neuroprotetor; e imunofluorescência manchando para avaliar a sobrevivência neuronal.