Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

El modelado in vitro es una herramienta esencial en la investigación biomédica. Permite a los investigadores estudiar y controlar estrechamente mecanismos específicos en tipos de células restringidas, o en sistemas u órganos aislados. El cultivo de rebanadas organotípicas es una técnica in vitro ampliamente utilizada, especialmente en el campo de la neurociencia¹. El método fue establecido por primera vez por El sr. G-hwiler, que cultivaba rebanadas cerebrales usando la técnica de tubo de rodillo^2,y más tarde modificado por Yamamoto et al., que introdujeron el uso de una membrana microporosa para realizar cultivos de rebanadas corticales³. En comparación con los cultivos celulares primarios, los cultivos de rebanadas organotípicas presentan la ventaja de preservar la citoarquitectura del tejido, así como las conexiones celulares nativas en el plano de la sección del tejido.

Las rebanadas organotípicas se han cultivado desde muchas partes del sistema nervioso central, como el hipocampo^4,la corteza^5,el estriado^6,el cerebelo^4,7,y la médula espinal^8,9,entre otros. Se ha demostrado que son una herramienta poderosa en los estudios de descubrimiento de fármacos¹⁰. Los efectos de las moléculas neuroactivas se pueden evaluar de muchas maneras: supervivencia y neurodegeneración mediante inmunomanchas y ensayos bioquímicos, formación de circuitos neuronales, o interrupción mediante electrofisiología y imágenes en vivo.

El objetivo de este trabajo es describir un método simple para realizar el cultivo organotípico de rodajas cerebelosas, que se sabe que es un modelo relevante para imitar el desarrollo cerebeloso in vitro. Particularmente, nos centramos en el estudio de la muerte del desarrollo celular de Purkinje. In vivo, las células de Purkinje se someten a apoptosis durante la primera semana postnatal, alcanzando su punto máximo en el día postnatal 3 (P3)¹¹. El mismo patrón se observa en el cultivo de rodajas cerebelosas, con las neuronas Purkinje muriendo por apoptosis cuando la cerebella se toma de animales entre P1 y P8, con un pico en P3^4,12. El uso de los cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas ha permitido identificar varias moléculas neuroprotectoras^7,13, así como la comprensión de parte de los mecanismos involucrados en esta muerte celular programada^14,15,16. Aquí, describimos un protocolo basado en el estudio de Stoppini et al.¹⁷ en el hipocampo, y adaptado al cerebelo por Dusart et al.⁴ Incluye disección rápida y corte de cerebella postnatal; cultivo de corte en un inserto de cultivo celular que contiene una membrana microporosa, con o sin tratamiento neuroprotector; y la tinción de inmunofluorescencia para evaluar la supervivencia neuronal.