Purkinje Cell выживания в органотипической церебеллярной части культур

Моделирование in vitro является важным инструментом в биомедицинских исследованиях. Это позволяет следователям изучать и жестко контролировать конкретные механизмы в ограниченных типов клеток, или в изолированных системах / органах. Органотипическая срезная культура широко используется в пробирке техника, особенно в области неврологии¹. Метод был впервые создан Гюхвилер, который культивируется мозг ломтиками с помощью роликовой трубки техники², а затем изменены Ямамото и др., который ввел использование микропористых мембраны для выполнения корковых культур ломтик³. По сравнению с первичными культурами клеток, органотипические срезные культуры представляют собой преимущество сохранения цитоархитектуры ткани, а также родных клеточных соединений в плоскости ткани.

Органотипические ломтики были культивированы из многих частей центральной нервной системы, таких как гиппокамп^4,кора^5,стриатум^6,мозжечок^4,7,и спинной мозг 8^,9, среди других. Они были доказаны, чтобы быть мощным инструментом в исследованиях открытия наркотиков¹⁰. Эффекты нейроактивных молекул можно оценить по-разному: выживание и нейродегенерация с помощью иммуностоинга и биохимии анализов, формирования нейрональных цепей, или нарушения с помощью электрофизиологии и живой визуализации.

Цель этой работы состоит в том, чтобы описать простой метод для выполнения органотипической мозжечковой культуры ломтик, который, как известно, соответствующая модель для имитации мозжечкового развития в пробирке. В частности, мы сосредоточились на изучении смерти клеток Пуркинье. In vivo, Purkinje клетки проходят апоптоз в течение первой послеродовой недели, достигнув пика в послеродовой день 3 (P3)¹¹. Такая же картина наблюдается в мозжечковой культуры ломтик, с Purkinje нейронов умирают от апоптоза, когда церебелла взяты из животных между P1 и P8, с пиком на P3^4,12. Использование органотипических мозжечковых культур ломтик позволило определить несколько нейропротекторных молекул^7,13, а также понимание части механизмов, участвующих в этой запрограммированной клеточной смерти^14,15,16. Здесь мы описываем протокол, основанный на изучении Stoppini et al.¹⁷ в гиппокампе, и адаптированный к мозжечке Dusart et al.⁴ Он включает в себя быстрое вскрытие и измельчение послеродовой церебелли; нарезка культуры на вставку клеточной культуры, содержащая микропористую мембрану, с нейропротекторным лечением или без нее; и иммунофлуоресценции окрашивания для оценки выживаемости нейронов.