Summary

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Abstract

Organotipik dilim kültürü, vivo koşullarda ayrışmış birincil hücre kültürlerinden daha yakından taklit eden güçlü bir in vitro modeldir. Erken doğum sonrası gelişiminde, serebellar Purkinje hücrelerinin programlanmış hücre ölümü sırasında savunmasız bir dönemden geçtiği bilinmektedir. Burada, bu kritik dönemde fare organotipik serebellar dilim kültürünü gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Dilimler purkinje hücre sağkalım ve nöroprotektif tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için daha fazla etiketlenir. Bu yöntem yeni nöroaktif molekülleriçin ekran için son derece değerli olabilir.

Introduction

In vitro modelleme biyomedikal araştırmalarda önemli bir araçtır. Araştırmacıların kısıtlı hücre tiplerinde veya izole sistemlerde/organlarda belirli mekanizmaları incelemesine ve sıkı bir şekilde kontrol etmesine olanak tanır. Organotipik dilim kültürü özellikle nöroloji alanında in vitro tekniğinde yaygın olarak kullanılan bir kültürdür1. Yöntem ilk Gähwiler tarafından kuruldu, kim roller tüptekniği2 kullanarak beyin dilimleri kültürlü , ve daha sonra Yamamoto ve ark tarafından modifiye, kortikal dilim kültürleri gerçekleştirmek için mikrogözenekli membran kullanımı tanıttı3. Birincil hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim kültürleri doku sitomimarisinin yanı sıra doku bölümünün düzleminde yerli hücre-hücre bağlantılarını koruma avantajını sunar.

Organotipik dilimler merkezi sinir sisteminin birçok yerinden kültürlü olmuştur, hipokampus gibi4, korteks5, striatum6, beyincik4,7, ve omurilik8,9, diğerleri arasında. Onlar ilaç keşif çalışmalarında güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır10. Nöroaktif moleküllerin etkileri birçok şekilde değerlendirilebilir: immünboyama ve biyokimya testleri kullanılarak sağkalım ve nörodejenerasyon, nöronal devre oluşumu, ya da elektrofizyoloji ve canlı görüntüleme kullanarak bozulma.

Bu çalışmanın amacı, in vitro serebellar gelişimi taklit etmek için ilgili bir model olduğu bilinen organotipik serebellar dilim kültürü gerçekleştirmek için basit bir yöntem tanımlamaktır. Özellikle Purkinje hücre gelişimsel ölümü üzerine yoğunlaştık. In vivo, Purkinje hücreleri ilk doğum sonrası hafta boyunca apoptoz geçmesi, postnatal gün 3 pik (P3)11. Aynı desen serebellar dilim kültüründe gözlenir, Cerebella P1 ve P8 arasında hayvanlardan alındığında Purkinje nöronlar apoptosis tarafından ölüyor, P3 bir tepe ile4,12. Organotipik serebellar dilim kültürlerin kullanımı çeşitli nöroprotektifmolekülleritanımlamak için izin verdi 7,13, yanı sıra bu programlanmış hücre ölümü dahil mekanizmaların bir kısmını anlamak14,15,16. Burada, Hipokampus Stoppini ve ark.17 çalışmasına dayalı bir protokol tarif ve Dusart ve ark.4 Tarafından beyincik adapte bu hızlı diseksiyon ve postnatal serebella doğrama içerir; nöroprotektif tedavi li veya olmadan, mikrogözenekli membran içeren bir hücre kültürü eklemek üzerine dilimleme kültürü; ve nöronal sağkalımı değerlendirmek için immünoresans boyama.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm deneyler Northwestern Üniversitesi Hayvan Araştırmaları komitesine uygun olarak yapılmıştır. 1. Organotipik serebellar dilim kültürleri öncesinde hazırlık Önceden etanol püskürtülen bir hücre kültüründe, steril şişe alıcısına bağlı 250 mL şişe üstü vakum filtresinde 200 mL kültür ortamı hazırlayın. 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), 50 mL Hanks’in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 50 mL ısı yalıtımlı at serumu, 1 mL 200…

Representative Results

Şekil 4’tegösterildiği gibi, bu protokol, purkinje hücre sağkalımının immünfloresans ve görüntü edinim adımlarından sonra değerlendirilebileceği organotipik serebellar dilim kültürleri üretmektedir. Purkinje hücreleri anti-Calbindin D-28K (seyreltme 1/200) ve Alexa594 anti-fare (seyreltme 1/300) antikorları kombinasyonu ile etiketlenmiştir. Görüntü dikiş otomatik olarak mikroskop satın alma yazılımı (NIS-Elements) tarafından tüm serebellar dilim bir resim elde…

Discussion

Serebellar dilim kültürü, doğum sonrası gelişim sırasında programlanmış Purkinje hücre ölümünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Ana avantajı kurulum basit ve çok uygun maliyetli olmasıdır, ve sadece ekipman mütevazı bir yatırım gerektirir (bir vibratom kadar mal olabilir 3 kat daha fazla bir doku helikopteri). Ayrıca, 10 ila 15 sağlıklı dilimler bir fare yavrusu ndan oluşturulabilir,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi’nde NCI CCSG P30 CA060553 tarafından cömertçe desteklenen ve Robert H Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi’ne verilen görüntüleme çalışmaları gerçekleştirildi. Biz sean McDermott onun teknik yardım ve destek için teşekkür ederim, ve Maya Epstein şekil 1gösterilen elle çizilmiş çizimler için .

Materials

Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody ThermoFisher scientific A21203
Basal Medium Eagle (BME) ThermoFisher scientific 21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2 NuAire NU-540-400
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) Abcam ab82812
CO2 Incubator NuAire NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher Scientific 07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm Fisher Scientific 12-545-E
Dressing forceps, straight Harvard Apparatus 72-8949
Double edge blades Fisher Scientific 50949411
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc 2701
Eye Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8428
Fine forceps Fisher Scientific 16-100-127
L-Glutamine 100X ThermoFisher scientific 25030149
Glucose solution ThermoFisher scientific A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution ThermoFisher scientific 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Fisher Scientific H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin ThermoFisher scientific 26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper Fisher Scientific NC9914528
Microprobes Fisher Scientific 08-850
Millicell Cell Culture Inserts Millipore Sigma PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL ThermoFisher scientific 168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system Nikon
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Paraformaldehyde Acros Organics 41678-0010
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher scientific P10144
Operating Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8403
Orbital shaker Belly Dancer IBI Scientific BDRLS0003
Prism 8 GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring Fisher Scientific FB012921
Tissue culture plate, 24 well Falcon/Corning 353047
Transfer pipettes, sterile ThermoFisher scientific 13-711-21
Triton X-100 ThermoFisher scientific BP151-500

References

  1. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  2. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  3. Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
  4. Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
  5. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
  6. Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
  7. Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
  8. Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
  9. Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
  10. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  11. Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
  12. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
  13. Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
  14. Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
  15. Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
  16. Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
  17. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  18. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  19. Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
  20. Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
  21. Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
  22. Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
  23. Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).

Play Video

Cite This Article
Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60353, doi:10.3791/60353 (2019).

View Video