Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.
Organotipik dilim kültürü, vivo koşullarda ayrışmış birincil hücre kültürlerinden daha yakından taklit eden güçlü bir in vitro modeldir. Erken doğum sonrası gelişiminde, serebellar Purkinje hücrelerinin programlanmış hücre ölümü sırasında savunmasız bir dönemden geçtiği bilinmektedir. Burada, bu kritik dönemde fare organotipik serebellar dilim kültürünü gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Dilimler purkinje hücre sağkalım ve nöroprotektif tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için daha fazla etiketlenir. Bu yöntem yeni nöroaktif molekülleriçin ekran için son derece değerli olabilir.
In vitro modelleme biyomedikal araştırmalarda önemli bir araçtır. Araştırmacıların kısıtlı hücre tiplerinde veya izole sistemlerde/organlarda belirli mekanizmaları incelemesine ve sıkı bir şekilde kontrol etmesine olanak tanır. Organotipik dilim kültürü özellikle nöroloji alanında in vitro tekniğinde yaygın olarak kullanılan bir kültürdür1. Yöntem ilk Gähwiler tarafından kuruldu, kim roller tüptekniği2 kullanarak beyin dilimleri kültürlü , ve daha sonra Yamamoto ve ark tarafından modifiye, kortikal dilim kültürleri gerçekleştirmek için mikrogözenekli membran kullanımı tanıttı3. Birincil hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim kültürleri doku sitomimarisinin yanı sıra doku bölümünün düzleminde yerli hücre-hücre bağlantılarını koruma avantajını sunar.
Organotipik dilimler merkezi sinir sisteminin birçok yerinden kültürlü olmuştur, hipokampus gibi4, korteks5, striatum6, beyincik4,7, ve omurilik8,9, diğerleri arasında. Onlar ilaç keşif çalışmalarında güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır10. Nöroaktif moleküllerin etkileri birçok şekilde değerlendirilebilir: immünboyama ve biyokimya testleri kullanılarak sağkalım ve nörodejenerasyon, nöronal devre oluşumu, ya da elektrofizyoloji ve canlı görüntüleme kullanarak bozulma.
Bu çalışmanın amacı, in vitro serebellar gelişimi taklit etmek için ilgili bir model olduğu bilinen organotipik serebellar dilim kültürü gerçekleştirmek için basit bir yöntem tanımlamaktır. Özellikle Purkinje hücre gelişimsel ölümü üzerine yoğunlaştık. In vivo, Purkinje hücreleri ilk doğum sonrası hafta boyunca apoptoz geçmesi, postnatal gün 3 pik (P3)11. Aynı desen serebellar dilim kültüründe gözlenir, Cerebella P1 ve P8 arasında hayvanlardan alındığında Purkinje nöronlar apoptosis tarafından ölüyor, P3 bir tepe ile4,12. Organotipik serebellar dilim kültürlerin kullanımı çeşitli nöroprotektifmolekülleritanımlamak için izin verdi 7,13, yanı sıra bu programlanmış hücre ölümü dahil mekanizmaların bir kısmını anlamak14,15,16. Burada, Hipokampus Stoppini ve ark.17 çalışmasına dayalı bir protokol tarif ve Dusart ve ark.4 Tarafından beyincik adapte bu hızlı diseksiyon ve postnatal serebella doğrama içerir; nöroprotektif tedavi li veya olmadan, mikrogözenekli membran içeren bir hücre kültürü eklemek üzerine dilimleme kültürü; ve nöronal sağkalımı değerlendirmek için immünoresans boyama.
Serebellar dilim kültürü, doğum sonrası gelişim sırasında programlanmış Purkinje hücre ölümünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Ana avantajı kurulum basit ve çok uygun maliyetli olmasıdır, ve sadece ekipman mütevazı bir yatırım gerektirir (bir vibratom kadar mal olabilir 3 kat daha fazla bir doku helikopteri). Ayrıca, 10 ila 15 sağlıklı dilimler bir fare yavrusu ndan oluşturulabilir,…
The authors have nothing to disclose.
Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi’nde NCI CCSG P30 CA060553 tarafından cömertçe desteklenen ve Robert H Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi’ne verilen görüntüleme çalışmaları gerçekleştirildi. Biz sean McDermott onun teknik yardım ve destek için teşekkür ederim, ve Maya Epstein şekil 1gösterilen elle çizilmiş çizimler için .
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
Brush | |||
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
ImageJ | |||
McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
Prism 8 | GraphPad | ||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |