הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר
Summary
תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.
Abstract
תרבות הפרוסה האורגנותית היא מודל רב-עוצמה החיקוי לvivo בתנאים הקרובים יותר מאשר בתרבויות תאים ראשיות שאינן מקבילות. בפיתוח מוקדם לאחר הלידה, המוח הפורקיאר Purkinje ידועים לעבור תקופה פגיעה, שבמהלכה הם עוברים מוות תאים מתוכנת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבצע העכבר באמצעות התרבות פרוסה בזמן קריטי זה. הפרוסות מסומנות עוד כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje ואת היעילות של טיפולים נוירומגן. שיטה זו יכולה להיות רבת ערך למסך עבור מולקולות נוירואקטיביות חדשות.
Introduction
בדוגמנות חוץ גופית הוא כלי חיוני במחקר ביו רפואי. הוא מאפשר לחוקרים ללמוד ולשלוט היטב במנגנונים ספציפיים בסוגי תאים מוגבלים, או במערכות מבודדות/איברים. תרבות הפרוסה האורגנותית היא בשימוש נרחב בטכניקת מבחנה, במיוחד בתחום המוח המדעי1. השיטה הוקמה לראשונה על ידי Gähwiler, אשר מתרבות פרוסות המוח באמצעות טכניקת שפופרת רולר2, ומאוחר יותר שונה על ידי יאממוטו ואח ‘, מי הציג את השימוש של קרום מיקרונקבובי לבצע תרבויות פרוסה קורטיקלית3. בהשוואה לתרבויות התאים הראשוניים, תרבויות הפרוסה האורגאותיות מציגות את היתרון של שמירה על הארכיטקטורה הציטותאית של הרקמה, כמו גם התקשרויות מקוריות של תאי התא במישור של מקטע הרקמה.
פרוסות אורגאואיות מתורמות מחלקים רבים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס4,קליפת 5, סטריאטום6, המוח השני4,7, וחוט השדרה8,9, בין היתר. הם הוכחו להיות כלי רב עוצמה במחקר גילוי סמים10. ההשפעות של מולקולות נוירואקטיביות ניתן להעריך בדרכים רבות: הישרדות וניוון שימוש באמצעות חיסוני וביוכימיה assays, היווצרות מעגלים עצביים, או שיבוש באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה חיה.
מטרת העבודה הזאת היא לתאר שיטה פשוטה לביצוע תרבות פרוסה בצורת אורגנויוגית, שידועה כמודל רלוונטי לחיקוי התפתחות מעשית בתחום החוץ. במיוחד, התמקדנו במחקר של תא מוות התפתחותי של Purkinje. ב vivo, התאים Purkinje עוברים ואפופטוזיס במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, לשיא ביום לאחר הלידה 3 (P3)11. דפוס זהה הוא נצפתה בתרבות פרוסה של המוח, עם נוירונים purkinje מתים על ידי אפופטוזיס כאשר המוח נלקח מבעלי חיים בין P1 ו P8, עם שיא ב P34,12. השימוש בתרביות פרוסה בלבלר מאפשר לזהות מספר מולקולות נוירוגינים7,13, כמו גם הבנת חלק מהמנגנונים המעורבים במוות התאים המתוכנת הזה14,15,16. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על המחקר של סטופיני ואח ‘17 ב היפוקמפוס, והותאם המוח המהיר על ידי דוארט ואח ‘4 זה כולל חיתוך מהיר וחיתוך של המוח פוסט לידה; לחתוך את התרבות על הוספת תרבות התא המכיל קרום מיקרונקבובי, עם או בלי טיפול נוירומגן; וכתמים מאימונועצביים כדי להעריך את ההישרדות העצבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרבות פרוסה בלבלר הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מתוכנת Purkinje מתוכנתים המוות במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי במהירות מולקולות מועמד במסך עבור הפוטנציאל הנוירולוגי שלהם. היתרון העיקרי הוא כי ההתקנה היא פשוטה וחסכונית מאוד, והוא רק דורש השקעה צנועה ציוד (משחק הרטט יכול לעלות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת הדמיה בוצעה במרכז אוניברסיטת נורת’ווסטרן עבור מיקרוסקופ מתקדם נתמך על ידי NCI CCSG P30 CA060553 הוענק למרכז רוברט ה לוריא מקיף סרטן. אנו מודים לשון מקדרמוט על הסיוע והתמיכה הטכניים שלו, ומאיה אפשטיין לאיורים המוצגים ביד המוצגת באיור 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
