البقاء علي قيد الحياة خليه purkinje في الثقافات شريحة المخيخ الوراثية
Summary
الثقافات شريحة التنميط العضوي هي أداه قويه لدراسة العمليات العصبية أو التنكسية/التجدد. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي نماذج وفاه النمو العصبي للخلايا Purkinje في الثقافات شريحة الفئران المخيخ. هذا الأسلوب قد تستفيد البحوث في اكتشاف المخدرات نيوروبروتكتيف.
Abstract
ثقافة شريحة التنميط العضوي هو نموذج قوي في المختبر الذي يقلد في ظروف الجسم الآخر عن كثب من الثقافات الخلية الاوليه المنفصلة. في مرحله ما بعد الولادة المبكرة ، من المعروف ان خلايا المخيخ Purkinje تمر خلال فتره الضعف ، والتي تمر خلالها بموت الخلايا المبرمج. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لأداء الماوس الظاهرية شريحة المخيخ الثقافة خلال هذا الوقت الحرج. وتصنف الشرائح كذلك لتقييم بقاء الخلية Purkinje وفعالية العلاجات نيوروبروتكتيف. هذه الطريقة يمكن ان تكون قيمه للغاية للشاشة لجزيئات نيواكتيف جديده.
Introduction
النمذجة في المختبر هو أداه أساسيه في البحوث الطبية الحيوية. وهو يسمح للمحققين بدراسة ومراقبه أليات محدده في أنواع الخلايا المقيدة ، أو في النظم/الاجهزه المعزولة. ثقافة شريحة التنميط العضوي هي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع في المختبر ، وخاصه في مجال علوم الأعصاب1. تاسست هذه الطريقة لأول مره من قبل Gähwiler ، الذي مثقف شرائح الدماغ باستخدام تقنيه أنبوب الاسطوانه2، وتعديلها في وقت لاحق من قبل ياماموتو وآخرون ، الذي ادخل استخدام غشاء ميكرومساميه لأداء الثقافات شريحة القشرية3. بالمقارنة مع ثقافات الخلايا الاوليه ، تقدم ثقافات الشريحة العضوية ميزه الحفاظ علي البنية الخلوية للانسجه ، فضلا عن اتصالات خلايا الخلايا الاصليه في الجزء الخاص بالانسجه.
وقد تم استزراع شرائح التنميط العضوي من أجزاء كثيره من الجهاز العصبي المركزي ، مثل الحصين4، اللحاء5، سترياتوم6، المخيخ4،7، والحبل الشوكي8،9، من بين أمور أخرى. وقد ثبت انها أداه قويه في دراسات اكتشاف المخدرات10. يمكن تقييم اثار الجزيئات العصبية بطرق عديده: البقاء علي قيد الحياة والضمور العصبي باستخدام اختبارات المناعة والكيمياء الحيوية ، وتشكيل دوائر الخلايا العصبية ، أو التعطيل باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير الحي.
والهدف من هذا العمل هو وصف طريقه بسيطه لأداء ثقافة شريحة المخيخ المجسمة ، والتي من المعروف انها نموذج مناسب لتقليد التطور المخيخ في المختبر. وعلي وجه الخصوص ، ركزنا علي دراسة وفاه الخلية Purkinje النمو. في الجسم المجري, خلايا Purkinje الخضوع للخلايا المبرمج خلال الأسبوع الأول بعد الولادة, ذروتها في اليوم بعد الولادة 3 (P3)11. لوحظ نفس النمط في الثقافة شريحة المخيخ ، مع الخلايا العصبية purkinje الموت من قبل المبرمج عندما تؤخذ المخيخ من الحيوانية بين P1 و P8 ، مع ذروه في P34،12. وقد سمح استخدام الثقافات شريحة المخيخ الشكل العضوي لتحديد عده جزيئات نيوروبروتكتيف7,13, فضلا عن فهم جزء من أليات المعنية في هذه الخلية المبرمجة الموت14,15,16. هنا ، ونحن وصف بروتوكول يستند إلى دراسة ستوبيني وآخرون17 في الحصين ، وتكييفها مع المخيخ من قبل dusart وآخرون4 ويشمل تشريح السريع وتقطيع المخيخ بعد الولادة. تشريح الثقافة علي الخلية الثقافة ادراج تحتوي علي غشاء ميكرومساميه ، مع أو بدون علاج نيوروبروتكتيف ؛ وتلطيخ المناعي لتقييم بقاء الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الثقافة شريحة المخيخ هو أداه قويه لدراسة الموت المبرمجة الخلية Purkinje اثناء التنمية بعد الولادة. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات المرشحة بسرعة لإمكاناتها المحصنة. الميزة الرئيسية هي ان الاعداد بسيط وفعال من حيث التكلفة جدا ، ويتطلب فقط استثمار متواضع في المعدات (يمكن ان تكلف الذبذب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأجريت اعمال التصوير في مركز جامعه نورث وسترن لمجهر المتقدمة بسخاء بدعم من الكلية CCSG P30 CA060553 منحت لمركز روبرت H لوري الشامل للسرطان. نشكر شون ماكدرمت لمساعدته الفنية ودعمه ، ومايا ابستاين للرسوم التوضيحية المرسومة باليد المبينة في الشكل 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
