Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados
Summary
Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.
Abstract
Los ratonesnulos de cadena NOD/SCID/IL-2 humanizados recapitulan algunas características de la inmunidad humana, que pueden ser explotadas en la investigación básica y preclínica sobre enfermedades infecciosas. Aquí se describen tres modelos de ratones inmunodeficientes humanizados para estudiar la dinámica de la infección por VIH. La primera se basa en la inyección intrahepática de CD34+ células madre hematopoyéticas en ratones recién nacidos, lo que permite la reconstitución de varias células confinadas de sangre y tejido linfoide, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Este modelo permite la monitorización de hasta 36 semanas después de la infección y por lo tanto se llama el modelo crónico. El segundo y el tercer modelo se conocen como modelos agudos y de reactivación, en los que las células mononucleares de sangre periférica se inyectan por vía intraperitoneal en ratones adultos. En el modelo agudo, las células de un donante sano se injertan a través de la vía intraperitoneal, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Por último, en el modelo de reactivación, las células de un donante infectado por el VIH bajo tratamiento antirretroviral se injertan por vía intraperitoneal. En este caso, un entorno libre de drogas en el ratón permite la reactivación de virus y un aumento de la carga viral. Los protocolos proporcionados aquí describen el enfoque experimental convencional para los modelos de ratón humanizados e inmunodeficientes de la infección por VIH.
Introduction
El modelo de ratón humanizado NOD/SCID/interleukin (IL)-2-chain-chain null (en adelante, huNS -cadenanula)ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la patogénesis de infecciones, autoinmunidad y cáncer, así como para estudios preclínicos de fármacos y terapias basadas en células humanas1,2. Estos ratones se basan en un fondo diabético no obeso (NOD), con la mutación scida y la mutación dirigida en el locus de cadena del receptor IL-2 (cadena común para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que inducen un deterioro grave en el desarrollo de células de ratón T-, B- y natural killer (NK)1. Por lo tanto, apoyan el injerto de tejido humano, humano CD34+ células madre hematopoyéticas (HSC), y células mononucleares de sangre periférica humana (PPBM)3,4,5. Además, la expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos, como el factor de células madre (SCF), el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrorófagos (GM-CSF), y la IL-3 promueve el injerto de las poblaciones mieloides humanas6,7,8.
Para los estudios sobre el VIH, se han descrito varios modelos de ratónnulo de cadena huNS, que difieren en la tensión del ratón, el tipo de células humanas utilizadas, el tipo de tejidos para el injerto y el origen de las células (es decir, sanos vs. Donante infectado por el VIH)9,10. La cepa original, sin embargo, es ampliamente utilizada debido a los altos niveles de injerto de células humanas y replicación viral después de la infección con una cepa de referencia del VIH11,12,13. Cepas similares de ratón inmunodeficientes con expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos (p. ej., NOG-EXL o NSG-SGM3) o con implantes de hígado humano y tejidos de timo (ratones de médula ósea-hígado-timo [BLT]) son útiles para evaluar el papel de las poblaciones mieloides en la respuesta inmune anti-VIH, los efectos del VIH en estos tejidos y su participación como reservorios virales14,15. Además, algunas cepas con expresión transgénica de moléculas de antígeno leucocito humano (HLA), así como ratones BLT, se pueden utilizar para estudiar la respuesta de las células T a la infección por VIH16,17.
En general, en estos ratones, la humanización depende del origen celular, la vía de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiaca) y la edad del ratón en el momento del injerto18,19,20. En cuanto al origen celular, se puede inyectar en ratones recién nacidos o jóvenes CD34+ HSC derivados de la sangre del cordón umbilical, el hígado fetal o la sangre periférica movilizada3,21. Además, los ratonesnulos de cadena adulta pueden ser humanizados por la inyección de PBMC (en este caso, conocido como ratonesnulos de cadena hu-PBL-NS), permitiendo la circulación temporal de estas células en la sangre, órganos linfoides secundarios y tejidos inflamados22,23,24.
Aquí se describe un protocolo detallado para el establecimiento de modelos de ratónnulo de cadena huNS para el estudio de la infección por VIH. El primero es el modelo crónico, en el que los CD34+ HSC humanos derivados de la sangre del cordón umbilical de un donante sano se inyectan en ratones recién nacidos, seguido de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 14 semanas de reconstitución del sistema inmunitario humano. Este modelo permite la monitorización de ratones durante un máximo de 36 semanas después de la infección. El segundo modelo es un modelo agudo, en el que los PMAC derivados de un donante sano se inyectan en ratonesnulos adultos de cadena NS, seguidos de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 3 semanas de expansión de células T humanas en el ratón. Por último, el tercer modelo es el modelo de reactivación, en el que se inyectan PAPI derivados de un donante infectado por el VIH bajo terapia antirretroviral supresiva (TAR) en ratonesnulos adultos de cadena NS. En este caso, un entorno libre de drogas permite la reactivación viral y el aumento de la carga viral. Los dos últimos modelos permiten la monitorización hasta 9 semanas después del injerto.
En general, estos tres modelos son útiles para estudios virológicos, estudios preclínicos de nuevos fármacos y la evaluación de los efectos de la infección por VIH en la respuesta inmunitaria global. También es importante considerar que el uso de ratones humanizados infectados por el VIH requiere la revisión y aprobación por parte del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC), así como por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) antes de cualquier experimento. Esto garantiza que el estudio siga todas las regulaciones institucionales internas y externas para el uso de material biológico peligroso y el manejo humano de animales experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han logrado importantes avances en el desarrollo de cepas de ratón inmunodeficientes para la humanización, con una serie de opciones diferentes que se pueden utilizar según el interés de la investigación1. Aquí se proporciona un protocolo general para la humanización de ratonesnulos de cadena NS y cepas genéticamente similares que se emplearán en tres modelos diferentes para el estudio de la infección por VIH. En el primer enfoque experimental, los ratones recién nacidos i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los fondos internos de la división clínica del IHV a JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
