Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen
Summary
Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.
Abstract
Gehumaniseerd NOD/SCID/IL-2 receptor γ-ketenNull muizen recapituleren sommige kenmerken van de menselijke immuniteit, die kunnen worden misbruikt in basis-en preklinisch onderzoek naar besmettelijke ziekten. Hier beschreven zijn drie modellen van gehumaniseerd immunodeficiënte muizen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie. De eerste is gebaseerd op de Intrahepatische injectie van CD34+ hematopoietische stamcellen in pasgeboren muizen, die de reconstitutie van verschillende bloed-en lymfoïde weefsel-besloten cellen mogelijk maakt, gevolgd door infectie met een referentie-HIV-stam. Dit model maakt monitoring mogelijk tot 36 weken na infectie en wordt daarom het chronische model genoemd. De tweede en derde modellen worden de acute en reactiverings modellen genoemd, waarin perifere bloed mononucleaire cellen intraperitoneaal worden geïnjecteerd bij volwassen muizen. In het acute model worden cellen van een gezonde donor geënt via de intraperitoneale route, gevolgd door een infectie met een referentie-HIV-stam. Tot slot worden in het reactiveringsmodel cellen van een HIV-geïnfecteerde donor onder antiretrovirale therapie via de intraperitoneale route geënt. In dit geval, een drug-vrije omgeving in de muis zorgt voor virus reactivering en een toename van de virale belasting. De protocollen die hier worden beschreven, beschrijven de conventionele experimentele aanpak voor gehumaniseerde, immunodeficiënte muizen modellen van HIV-infectie.
Introduction
De gehumaniseerde NOD/SCID/Interleukine (IL)-2-receptor γ-ketenNull (hierna genoemd huns γ-ketenNull) muismodel is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de pathogenese van infecties, auto-immuniteit, en Cancer, evenals voor pre-klinische studies van drugs en menselijke cel gebaseerde therapieën1,2. Deze muizen zijn gebaseerd op een niet-zwaarlijvige diabetische (NOD) achtergrond, met de scid -mutatie en gerichte mutatie bij de Il-2-receptor γ-Chain Locus (gemeenschappelijke γ-keten voor Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15 en Il-21), die een ernstige aantasting veroorzaken bij de ontwikkeling van muis T-, B-en Natural Killer (NK)-cellen1. Zo ondersteunen ze het engraftment van menselijk weefsel, humane CD34+ hematopoietische stamcellen (hscs) en humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)3,4,5. Bovendien bevordert transgene expressie van menselijke hematopoietische factoren, zoals stamcel factor (SCF), granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), en Il-3 de engraftment van menselijke myeloïde populaties6,7,8.
Voor HIV-onderzoeken zijn verschillende huNS γ-ChainNull -Muismodellen beschreven, die verschillen in de muis stam, het type gebruikte menselijke cellen, het type weefsels voor de engraftment en de oorsprong van cellen (d.w.z. gezond versus HIV-geïnfecteerde donor)9,10. De oorspronkelijke stam, echter, wordt veel gebruikt als gevolg van de hoge niveaus van menselijke cellen engraftment en virale replicatie na infectie met een verwijzing HIV-stam11,12,13. Soortgelijke immunodeficiënte muizenstammen met transgene expressie van menselijke hematopoietische factoren (bijv. nog-EXL of NSG-SGM3) of met implantaten van menselijke lever en Thymus weefsels (beenmerg-lever-Thymus [blt] muizen) zijn nuttig voor het evalueren van de rol van myeloïde populaties in de anti-HIV-immuunrespons, effecten van HIV op deze weefsels, en hun deelname als virale reservoirs14,15. Bovendien kunnen sommige stammen met een transgene expressie van humane leukocytenantigeen (HLA) moleculen, evenals blt-muizen, worden gebruikt voor het bestuderen van de T-cel respons op HIV-infectie16,17.
In het algemeen, in deze muizen, is de humanisatie afhankelijk van de cellulaire oorsprong, de toedieningsroute (intraperitoneale, Intrahepatische, intraveneuze, intracardiac) en muis leeftijd op het moment van engraftment18,19,20. Met betrekking tot de celoorsprong kan Human CD34+ HSC afgeleid van snoer bloed, foetale lever of gemobiliseerd perifeer bloed worden geïnjecteerd bij pasgeborenen of jonge muizen3,21. Bovendien kunnen volwassen γ-ketennulmuizen worden gehumaniseerd door de injectie van PBMC (hier, aangeduid als Hu-PBL-NS γ-ChainNull muizen), waardoor de temporale circulatie van deze cellen in het bloed, secundaire lymfoïde organen en ontstoken weefsels22,23,24.
Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor het opzetten van huNS γ-ChainNull Muismodellen voor de studie van HIV-infectie. De eerste is het chronische model, waarbij humane CD34+ hscs afgeleid van bloed van een gezonde donor worden geïnjecteerd in pasgeboren muizen, gevolgd door infectie met een referentie HIV-stam na 14 weken van het menselijk immuunsysteem reconstitutie. Dit model maakt het mogelijk om muizen te monitoren tot ~ 36 weken na infectie. Het tweede model is een acuut model, waarin PBMCs, afgeleid van een gezonde donor, worden geïnjecteerd in volwassen NS γ-ketennulmuizen , gevolgd door infectie met een referentie-HIV-stam na 3 weken menselijke T-cel expansie in de muis. Ten slotte is het derde model het reactiveringsmodel, waarin PBMCs, afkomstig van een HIV-geïnfecteerde donor onder suppressieve antiretrovirale therapie (kunst), wordt geïnjecteerd in volwassen NS γ-Chainnulmuizen . In dit geval, een drug-vrije omgeving zorgt voor virale reactivering en verhoging van de virale belasting. De twee laatste modellen maken bewaking mogelijk tot ~ 9 weken na engraftment.
Over het algemeen zijn deze drie modellen nuttig voor virologische studies, preklinische studies van nieuwe geneesmiddelen, en evaluatie van HIV-infectie effecten op de wereldwijde immuunrespons. Het is ook belangrijk om te bedenken dat het gebruik van met HIV geïnfecteerde gehumaniseerde muizen moet worden herzien en goedgekeurd door het Comité voor institutionele bioveiligheid (IBC) en door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) voor een experiment. Dit zorgt ervoor dat de studie alle interne en externe institutionele voorschriften voor het gebruik van gevaarlijk biologisch materiaal en humane hantering van proefdieren volgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belangrijke vooruitgang is bereikt in de ontwikkeling van immunodeficiënte muizenstammen voor de humanisering, met een aantal verschillende opties die kunnen worden gebruikt in overeenstemming met het onderzoek belang1. Hier is een algemeen protocol voor de humanisering van NS γ-ketennulmuizen en genetisch vergelijkbare stammen die moeten worden gebruikt in drie verschillende modellen voor het BESTUDEREN van HIV-infecties. In de eerste experimentele benadering worden bestraalde pasgeb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van de IHV Clinical Division aan JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
